长链非编码RNA LINC00319通过LINC00319/let-7a-5p/HMGA2机制调节胶质瘤的增殖

鲍 红,陈 波(西电集团医院麻醉科,西安 710077;通讯作者,E-mail:3354459283@qq.com)

胶质瘤是成人中枢神经系统最致命、最常见的原发性恶性肿瘤,根据其组织病理学特征及恶性程度分为低分级胶质瘤(WHO Ⅰ级、Ⅱ级)和高分级胶质瘤(WHO Ⅲ级、Ⅳ级)[1,2]。目前胶质瘤的治疗策略包括手术、放疗和化疗,虽然在一定程度上减缓了病情,但是由于胶质瘤的高复发和转移,患者的预后仍较差[1]。因此,深入研究胶质瘤形成和发展的相关分子机制,寻找新的治疗靶点,为制定胶质瘤治疗策略提供更好理论基础。

长链非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA)是长度超过200个核苷酸的非蛋白编码转录本。近年来的研究表明,lncRNA参与肿瘤的生长、血管生成、侵袭、上皮间质转化、转移和多种肿瘤的耐药。lncRNA已被证实在多种人类肿瘤的进展中起关键作用,其可通过与mRNA、蛋白分子等ncRNAs直接或间接地相互作用,在基因表达的精细调控中发挥重要作用[2-5]。目前已经鉴定出几种lncRNA与胶质瘤的诊断、进展、预后和治疗效果有关[2-5]。近年来的研究表明,LINC00319是一种疾病lncRNA,已被证明可调节肺癌[6]、鼻咽癌[7]和卵巢癌[8]的进展。然而,LINC00319在胶质瘤中的表达及潜在作用尚不清楚。

本研究检测lncRNA-LINC00319在胶质瘤组织及胶质瘤细胞中的表达,同时探讨LINC00319在胶质瘤中的作用及其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 胶质瘤组织来源

选取2015-01～2018-09西电集团医院神经外科手术切除的位于额叶的恶性胶质瘤标本6例,取同时期脑外伤手术中切除的脑组织1例作为对照组。取切除的胶质瘤组织中心位置约0.5 cm× 0.5 cm×0.5 cm大小的组织,立即将组织保存于液氮中,直到提取总RNA。所有患者术前均未接受放疗或化疗,本研究符合医学伦理学要求,术前患者或家属均签署研究知情同意书,并经西电集团医院医学伦理委员会批准。

1.2 细胞培养及主要试剂

人胶质瘤细胞系U251、A172、U87MG、正常人星形胶质细胞(NHA)均购自中国科学院上海细胞库。细胞于含有10%胎牛血清(Gibco,美国)和0.1%青链霉素(Gibco,美国)的RPMI-1640(Hyclone,美国)培养基中,37 ℃、5% CO2培养。待细胞融合度达到80%以上用于后续实验,细胞转染使用LipofectamineTM2000转染试剂(Invitrogen,美国),let-7a-5p Inhibitor及let-7a-5p mimics由Generalbiol公司合成,LINC00319干扰质粒及对照质粒(sh-LINC00319及sh-NC)、野生型及突变型LINC00319报告基因质粒(pmirGLO-LINC00319-WT, pmirGLO-LINC00319-MUT)、野生型及突变型HMGA2报告基因质粒(pmirGLO-HMGA2-WT,pmirGLO-HMGA2-MUT)均由西安外事学院医学院实验室构建。TURBO DNA-freeTMKit(Invitrogen,美国),PrimeScript RT试剂盒(TaKaRa,日本),SYBR Green PCR Master Mix (TaKaRa,日本),CCK8试剂盒(APExBIO,美国),Nuclei ez lysis Buffer(Sigma,美国)。

1.3 RNA提取和qRT-PCR

用Trizol试剂提取总RNA,然后用TurboDNase Kit去除DNA。使用NanoDrop对提取的RNA进行定量。使用PrimeScript RT试剂盒合成cDNA。利用SYBR Green PCR Master Mix在ABI 7500 Fast real-time PCR系统进行qPCR扩增,以GAPDH水平为对照,依次检测肿瘤和非肿瘤组织、人胶质瘤细胞系(U87MG、U251、A172)和正常人星形胶质细胞(NHA)、sh-NC(对照质粒)或sh-LINC00319处理后各细胞系中LINC00319的表达;qRT-PCR法检测胶质瘤细胞系(U87MG、U251、A172)和正常人星形胶质细胞(NHA)中let-7a-5p、HMGA2的表达情况,同时检测sh-NC(对照质粒)或sh-LINC00319处理、let-7a-5p inhibitor及let-7a-5p mimics加入后let-7a-5p和HMGA2的表达情况。Ct值采用Ct法计算,基因表达的相对变化以2-ΔΔCt法表达,引物见表1。

表1 所用引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.4 细胞增殖实验

采用CCK-8法检测细胞增殖能力。以5×103个/孔的数量接种于96孔板中,并在不同的转染条件下进行处理。在转染后0,24,48,72,96 h,每孔中分别加入CCK-8试剂20 μl,用ELx800(BioTek)于570 nm处测定每个样品的吸光度。根据吸光度值计算细胞存活率。

1.5 胶质瘤细胞的亚细胞分离

为了探索LINC00319参与胶质瘤细胞增殖的分子机制,首先分析了LINC00319在胶质瘤细胞U87MG、U251和A172细胞中的分布。利用RNAlocate[9]进行查询,并利用RT-qPCR鉴定LINC00319在细胞质与细胞核中的分布。实验使用sigma的细胞核裂解缓冲液分离试剂盒进行分离纯化细胞质RNA和核RNA,具体参照说明书操作。分离的细胞质RNA和核RNA,如1.3步骤所述,采用qRT-PCR检测LINC00319在核内和胞内的表达,分别以U6及GAPDH为参照,引物见表1。

1.6 生物信息学分析

使用DIANA-LncBase(http://carolina.imis.athena-innovation.gr/index.php?r=lncbasev2)和miRDB(http://mirdb.org/)预测LINC00319可能结合的目标microRNA,NCBI数据库下载(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)相关基因信息,miRDB和DIANA-LncBase、TargetScan7(http://www.targetscan.org/vert-71/)被用来分析预测的microRNA的靶点。

1.7 双荧光素酶报告基因检测

采用双荧光素酶报告基因实验验证预测的microRNAlet-7a-5p与LINC00319的作用。

将U251细胞接种于96孔板中,接种密度104/孔,第2天将40 nmol/L miR-NC mimics与野生型LINC00319报告基因质粒pmirGLO-LINC00319-WT或突变型LINC00319报告基因pmirGLO-LINC00319-MUT或对照质粒pmirGLO分别共转染,另外40 nmol/L let-7a-5p mimics与野生型LINC00319报告基因质粒pmirGLO-LINC00319-WT或突变型LINC00319报告基因pmirGLO-LINC00319-MUT或对照质粒pmirGLO分别共转染,每组3个复孔,48 h后每孔加入1×Passive溶解缓冲液50 μl,室温摇床孵育20 min。取30 μl裂解液/孔对应加入Costar白板中,每孔加入100 μl荧光素酶缓冲液,多功能酶标仪检测每个孔中萤火虫荧光素酶活性值。再次加入100 μl stop&GLO/孔,多功能酶标仪读取海肾荧光素酶活性值。荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值。

生物信息学法预测let-7a-5p的直接靶基因,采用荧光素酶报告基因系统验证let-7a-5p与预测基因HMGA2的相互作用。U251细胞中转染miR-NC mimics或者let-7a-5p mimics、野生型HMGA2报告基因质粒pmirGLO-HMGA2-WT或突变型HMGA2报告基因质粒pmirGLO-HMGA2-MUT,参照上述步骤,统计分析荧光素酶活性。

1.8 统计学分析

每个实验重复3次,数据以平均数±标准差表示。采用SPSS20.0统计软件进行数据处理,两组间比较采用独立样本t检验,三组间比较采用方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LINC00319在胶质瘤中高表达

RT-qPCR结果显示,LINC00319在晚期病理级别为Ⅳ级胶质瘤组织和Ⅲ级胶质瘤组织中较脑外伤组织表达升高(P<0.01,见图1)。与NHA比较,LINC00319在U87MG、U251和A172细胞中均显著高表达,并且与对照相比差异具有统计学差异(P<0.01,见图1)。

2.2 LINC00319基因下调可抑制胶质瘤细胞的增殖

qRT-PCR结果显示A172细胞、U87MG细胞和U251细胞转染sh-LINC00319后,细胞中LINC00319的表达均被抑制(P<0.01,见图2),但在U251和U87MG细胞中抑制更加明显。因此,后续实验在U251和U87MG细胞中进行。

CCK8结果表显示,sh-LINC00319可抑制U251和U87MG细胞增殖(P<0.05,见图2),提示沉默LINC00319可在体外抑制肿瘤生长。

2.3 LINC00319直接与let-7a-5p结合

RT-qPCR结果显示LINC00319在细胞核与细胞质中均有分布,但细胞质中LINC00319的含量高于细胞核中LINC00319的含量(P<0.01,见图3A),因此,LINC00319可能作为竞争性内源性RNA(ceRNA)在胶质瘤细胞的细胞质中发挥其促癌作用。生物学预测LINC00319潜在靶标为let-7a-5p,且let-7a-5p的序列与LINC00319连续8个碱基互补(见图3B)。RT-qPCR检测发现与NHA细胞比较,U87MG、U251和A172细胞中let-7a-5p均低表达(P<0.01,图3C)。双荧光素酶报告基因结果显示,let-7a-5p可以降低pmirGLO-LINC00319-WT的荧光素酶活性,但不能改变pmirGLO-LINC00319-MUT的荧光素酶活性(P<0.05,见图3D)。

图1 LINC00319在胶质瘤组织及胶质瘤细胞系中的表达Figure 1 LINC00319 expression in glioma cancer cells and tissues

图2 LINC00319基因的下调可抑制胶质瘤细胞的增殖Figure 2 Down-regulation of LINC00319 gene inhibited the proliferation of glioma cells

图3 LINC00319直接与let-7a-5p结合发挥功能Figure 3 LINC00319 directly interacts with let-7a-5p

为了进一步探讨LINC00319是否通过let-7a-5p发挥生物学功能,胶质瘤细胞U87MG和U251转染sh-LINC00319、共转染sh-LINC00319及let-7a-5p抑制剂,RT-qPCR结果显示转染sh-LINC00319处理组较对照组let-7a-5p表达量升高,而let-7a-5p抑制剂的加入可抵消由于LINC00319干扰引起的let-7a-5p高表达(P<0.01,图4A),这提示let-7a-5p表达与sh-LINC00319的表达呈负相关。CCK-8实验显示,let-7a-5p抑制剂可减弱胶质瘤细胞中sh-LINC00319的抑制增殖作用(P<0.05,图4B、C)。

图4 LINC00319通过调控let-7a-5p发挥作用Figure 4 LINC00319 plays a role in glioma by regulating let-7a-5p

2.4 LINC00319通过let-7a-5p调节HMGA2的表达

TargetScan、miRDB和DIANA预测let-7a-5p的直接靶基因,发现HMGA2可能是有效的靶基因,荧光素酶报告基因系统检测let-7a-5p与HMGA2相互作用,结果显示,let-7a-5p可以降低pmirGLO-HMGA2-WT的荧光素酶活性,但不能改变pmirGLO-HMGA2-MUT的荧光素酶活性(P<0.05,见图5A),这表明let-7a-5p可以通过识别特定位点直接与HMGA2结合。RT-qPCR检测结果显示,LINC00319抑制可在mRNA水平上抑制胶质瘤细胞U87MG和U251中HMGA2的表达,而let-7a-5p抑制剂可抵消sh-LINC00319对胶质瘤细胞U87MG和U251中HMGA2的影响(P<0.01,图5B)。

图5 LINC00319通过let-7a-5p调节HMGA2的表达Figure 5 LINC00319 promotes HMGA2 expression by interacting with let-7a-5p

3 讨论

基于胶质瘤的高复发率、低生存率及目前治疗的局限性,急切需要能更好地探寻胶质瘤发生的机制,促进胶质瘤有效治疗策略的发展[1,10]。近年来大量研究表明,lncRNA在胶质瘤进展中发挥了重要的功能作用[11,12]。肿瘤组织特异性的lncRNA谱可作为不同癌症的表型特征,用于癌症预后和治疗[13]的开发。近年来,有研究表明,LINC00319可能在肿瘤进展中作为一种致癌lncRNA,如Zhou等[6]研究表明LINC00319通过直接与肿瘤抑制因子miR-32结合并下调miR-32,促进肺癌细胞的增殖和侵袭;Zhang等[14]研究表明LINC00319通过调控miR-450b-5p/EZH2参与肺腺癌的发生。在本研究中,RT-qPCR检测了6例胶质瘤患者LINC00319的表达,结果显示LINC00319在胶质瘤组织较之对照组织表达增加,同时胶质瘤细胞系U251、U87MG和A172中LINC00319表达较NHA细胞亦显著增加,而在U251和U87MG细胞中下调LINC00319的表达则抑制胶质瘤细胞生长,这提示LINC00319可能在胶质瘤的进展中发挥作用。

越来越多的研究表明,lncRNA可以作为ceRNA发挥调节作用。Lu等[15]的研究表明,lncRNA BC032469通过miR-1207-5p上调hTERT(human telomerase reverse transcriptase)表达,促进胃癌细胞增殖。Fang等[16]认为lncRNA HNF1A-AS1通过调节miR-34a/SIRT1/p53的表达,通过发挥ceRNA的作用,促进了结肠癌的转移。然而,LINC00319在胶质瘤中的潜在作用尚不清楚。在本研究中,生物信息学分析和荧光素酶报告基因分析的数据显示,let-7a-5p可以通过识别特定位点直接与LINC00319结合,提示let-7a-5p可作为LINC00319的抑制靶点。另外qRT-PCR结果显示,let-7a-5p在胶质瘤细胞中表达下降,并与LINC00319表达呈负相关。此外,在sh-LINC00319转染的胶质瘤细胞中,let-7a-5p表达显著增加。let-7a-5p抑制剂可减弱胶质瘤细胞中sh-LINC00319导致的抑制增殖作用,综上所述,LINC00319可能通过调控let-7a-5p表达来抑制胶质瘤细胞的生长。

HMGA2是与染色体结合的非组蛋白,在许多恶性肿瘤中高表达并与预后有关。Li等[17]发现let-7a可靶向HMGA2并抑制胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移;Palmieri等[18]研究显示,靶向HMGA基因的miRNA的下调可能导致人垂体腺瘤HMGA蛋白水平升高,进而导致垂体肿瘤的发生。Gao等[19]研究表明HMGA2在miR-195的调控下对肺癌的增殖、转移和上皮间质转化发挥重要作用。然而lncRNA和HMGA2在胶质瘤中的相互作用尚不清楚。本研究中生物信息学预测显示HMGA2可能是let-7a-5p有效的靶基因,与NHA细胞比较,HMGA2在胶质瘤细胞U251和U87MG中高表达,而抑制LINC00319可抑制HMGA2在胶质瘤细胞U251和U87MG中的表达,同时let-7a-5p抑制剂可抵消因LINC00319抑制导致的HMGA2表达减少。这些结果表明,神经胶质瘤中LINC00319可能通过let-7a-5p调控HMGA2的表达。

总之,本研究表明,LINC00319通过let-7a-5p的功能促进胶质瘤的增殖,并提示在胶质瘤中存在一种新的LINC00319-let-7a-5p-HMGA2信号通路调控网络。这些结果提示,LINC00319有可能成为胶质瘤的潜在治疗靶点。但本文的临床组织标本量偏少,在后续的研究中,我们一方面将继续扩大标本量,为LINC00319-let-7a-5p-HMGA2作为胶质瘤标志物提供更加可靠的理论依据;另一方面,将从体外细胞分子水平及和体内裸鼠水平,进一步探讨LINC00319-let-7a-5p-HMGA2在胶质瘤发生发展中的作用。