去甲泽拉木醛对胃癌AGS细胞增殖和凋亡的影响及作用机制

杨 杨,崔忆旋,胡 婷,赵梦琳,汪子书(蚌埠医学院第一附属医院肿瘤内科,蚌埠 233000;通讯作者,E-mail:wzshahbb@163.com)

胃癌不仅是全球第四大常见癌症,也是导致癌症相关死亡的第二大原因[1]。目前胃癌的治疗包括手术、化疗、放疗和分子靶向治疗,其中手术联合放化疗是最有效的治疗方案[2]。然而,由于先天性或获得性耐药及术后复发,胃癌治疗已进入瓶颈期[3]。因此,有必要寻找与胃癌进展相关的新靶点和信号通路来治疗胃癌。肿瘤的发生发展与细胞不受控制的增殖密切相关,而许多恶性肿瘤细胞通过凋亡逃逸获得无限的增殖能力[4]。在20世纪70年代,Kerr等[5]提出了凋亡与消除潜在的恶性细胞、增殖和肿瘤进展相关的理论。目前凋亡的三种逃避机制被广泛接受,包括死亡受体通路的损伤、Caspase功能的减弱、促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白平衡的破坏[6]。因此,通过调控凋亡信号通路中关键蛋白或酶的表达或功能来靶向癌细胞凋亡成为癌症研究的热点[7]。此外,有报道称一些天然产物可调节细胞凋亡信号通路,最终导致癌细胞死亡。苦参碱是从苦参中提取的生物碱,通过促进促凋亡蛋白的表达,改变Fas/FasL,激活Caspase-3,促进胃癌细胞凋亡[8,9]。因此,从天然植物产物中寻找潜在的抗癌药物成为一项研究热点。

去甲泽拉木醛是从雷公藤中提取的三萜单体,广泛应用于抗炎免疫调节、抗生育、雌激素代谢调节等研究[10-13],近年去甲泽拉木醛的抗癌特性也在逐渐被开发。研究表明,去甲泽拉木醛在三阴性乳腺癌、胶质瘤及黑色素瘤中都发挥着明显的抗肿瘤作用[14-16]。但是,去甲泽拉木醛对胃癌的抗癌活性及其作用机制尚不清楚。本实验主要探讨去甲泽拉木醛对胃癌细胞(AGS)的影响及其可能机制,为胃癌的临床治疗提供新的策略。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂

人胃癌细胞AGS(人胃癌腺细胞系)购自美国American type culture collection公司,培养于蚌埠医学院癌症医学转化中心实验室。RPMI-1640培养基、胰蛋白酶(含EDTA)和双抗(青霉素/链霉素)购自美国Gibco公司,胎牛血清(FBS)购自杭州四季青公司,CCK-8试剂盒、BCA试剂盒、磷酸缓冲盐水溶液(PBS)购于上海碧云天公司,双染细胞凋亡检测试剂盒(Annexin Ⅴ-FITC/PI)购自杭州联科生物公司,结晶紫购自上海生工生物工程公司,瑞氏-吉姆萨染色液购于南京建成科技公司,ERK1/2、p-ERK1/2、cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3蛋白抗体购自美国CST公司。

1.2 细胞培养

人胃癌细胞AGS培养在含10% FBS、1%青霉素/链霉素的RPMI-1640完全培养基中,在37 ℃,5%CO2恒温培养箱中培养。

1.3 CCK-8实验检测细胞毒性

取对数生长期生长状态良好的人胃癌细胞AGS,胰酶消化得单细胞悬液,离心,弃上清,再次加入RPMI-1640完全培养基后计数,在96孔板中接种细胞悬液(100 μl/孔),每孔约含5 000个细胞,培养过夜,待细胞融合达80%左右加入不同浓度的去甲泽拉木醛(0,0.05,0.1,0.5,1,5,10,30,50 μmol/L)。将细胞放入37 ℃,5% CO2培养箱中孵育24 h每孔加入10 μl的CCK-8溶液。继续培养2 h,利用酶标仪于分光度为450 nm处测OD值,计算细胞在不同浓度去甲泽拉木醛下的活力:细胞活力(%)=(实验组OD值-空白对照组OD值)/(阴性对照组OD值-空白对照组OD值)×100%,计算药物的半数抑制浓度(IC50)。

1.4 克隆形成实验检测细胞增殖

取对数生长期生长状态良好的人胃癌细胞AGS,以每孔大约500个细胞接种于6孔板,依次加入0,0.05,0.1,0.5,1,10 μmol/L去甲泽拉木醛溶液。将6孔板放入37 ℃,5% CO2培养箱中持续7 d,直到空白组形成多于200个细胞克隆时,终止培养。丢弃培养基,用预先冷却的PBS溶液清洗两遍后,每孔加滴加800 μl甲醇固定30 min,弃甲醇。向每个孔中滴加800 μl瑞氏-吉姆萨染色液试剂一,以覆盖孔的底部,染色20 min。保留试剂一,滴加1 600 μl试剂二,轻轻摇晃,使两种染液充分混匀,染色20-25 min,倒去两种混合后的染色溶液,用自来水洗涤3次,自然风干并拍照。使用软件Image J,进行统计图像的灰度统计并计算抑制率,计算公式为:克隆形成抑制率=给药组的灰度值/溶剂对照组的灰度值×100%。

1.5 Transwell实验检测细胞迁移

取对数生长期生长状态良好的人胃癌细胞AGS,将含2×105个细胞的无血清细胞悬液加入至上层小室,并在上层小室中分别加入不同浓度的去甲泽拉木醛(0,1,3,10 μmol/L),在下层小室内加入600 μl的RPMI-1640完全培养基,培养24 h,丢弃上腔液,去除膜表面残留细胞。将小室用甲醇固定20 min,0.5%结晶紫染色20 min,最后,染色细胞用光学显微镜200倍放大观察和拍照。使用软件Image J计算细胞迁移的面积。

1.6 Annexin Ⅴ-FITC/PI双染检测细胞凋亡

选取对数期生长状态良好的AGS细胞,以每孔3×105的细胞密度接种于12孔板,待次日贴壁后加入浓度分别为0,1,3,10 μmol/L的去甲泽拉木醛,5% CO2恒温培养箱中培养24 h,收集上清于对应的流式管中,用不含EDTA的胰酶消化细胞,终止消化,将细胞收集到流式管中。500g离心5 min,弃上清,再用预冷的PBS清洗两遍,此步最后一次PBS均分出双阴、Annexin Ⅴ-FITC组和单PI组。每管加入400 μl Annexin Ⅴ-FITC结合液(1×binding buffer)混匀;加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC和10 μl PI染色液轻轻混匀于室温避光15 min孵育染色;在流式细胞仪上检测细胞凋亡率。

1.7 Western blot法检测ERK1/2、p-ERK1/2、cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3蛋白表达水平

用不同浓度的去甲泽拉木醛(0,1,3,10 μmol/L)处理细胞24 h,0.25%胰酶消化,离心分离收集细胞,PBS漂洗2次,在冰上加入PIPA细胞裂解液进行裂解,收集细胞的总蛋白,BCA法测定蛋白水平。将蛋白总量相同的样本加入到12%聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)内进行蛋白分离,转移至PVDF膜。5%脱脂牛奶在室温封闭2 h,TPBS洗涤7 min,重复3次。按1∶1 000的比例分别稀释β-actin、ERK1/2、p-ERK1/2、cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3一抗,膜与不同的一抗4 ℃孵育过夜,次日用与辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔IgG(二抗)室温下孵育2 h,ECL发光试剂盒显影。

1.8 统计学分析

利用GraphPad Prism 7软件进行分析实验数据,实验数据均以均数±标准差表示,各组间差异采用单因素方差分析和LSD-t检验比较各组间差异。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 去甲泽拉木醛对AGS细胞具有细胞毒性作用

CCK-8结果显示,AGS细胞经不同浓度去甲泽拉木醛(0,0.05,0.1,0.5,1,5,10,30,50 μmol/L)处理24 h,细胞的存活率随着去甲泽拉木醛浓度的升高而下降,表明去甲泽拉木醛对AGS细胞具有细胞毒性作用,作用24 h的IC50值为18.45 μmol/L。与0 μmol/L相比,差异具有统计学意义(P<0.05,见图1)。

与0 μmol/L相比,*P<0.05

2.2 去甲泽拉木醛对AGS细胞具有增殖抑制作用

AGS细胞经不同浓度去甲泽拉木醛处理7 d后,随着去甲泽拉木醛浓度的增加,克隆形成数量明显降低。与0 μmol/L相比,差异具有统计学意义(P<0.01,见图2)。

2.3 去甲泽拉木醛抑制AGS细胞迁移

用不同浓度去甲泽拉木醛处理AGS细胞24 h,观察其对细胞迁移能力的影响。Transwell实验结果显示,与对照组相比,去甲泽拉木醛明显抑制了胃癌细胞的迁移。此外,去甲泽拉木醛可抑制AGS细胞迁移,呈剂量依赖性(P<0.001,见图3)。

图2 去甲泽拉木醛对AGS细胞的增殖抑制作用Figure 2 The anti-proliferation activity of demethylzeylasteral in AGS cells

图3 去甲泽拉木醛对AGS细胞迁移的抑制作用Figure 3 Demethylzeylasteral suppressed the migration of AGS cells

2.4 去甲泽拉木醛诱导AGS细胞凋亡

Annexin Ⅴ-FITC/PI双染实验,流式分析结果显示不同浓度的去甲泽拉木醛(0,1,3,10 μmol/L)作用于人胃癌AGS细胞24 h,细胞发生凋亡,并且随着药物浓度的增加,细胞凋亡率明显增高。与0 μmol/L相比,不同浓度作用后细胞凋亡率差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.001,见图4);不同浓度组之间细胞凋亡率相比较,差异具有统计学意义(P<0.001,见图4)。

2.5 去甲泽拉木醛对AGS细胞凋亡相关蛋白及ERK1/2蛋白表达的影响

Western blot结果显示,与0 μmol/L相比,不同浓度的去甲泽拉木醛(1,3,10 μmol/L)作用于人胃癌AGS细胞24 h,细胞的cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3、p-ERK1/2蛋白表达量明显下调(P<0.05或P<0.001),而ERK1/2蛋白表达量无明显变化(见图5)。

图4 不同浓度去甲泽拉木醛处理24 h对AGS细胞凋亡的影响Figure 4 Effect of demethylzeylasteral on the apoptosis of AGS cells after treatment for 24 h

与0 μmol/L相比,**P<0.01,***P<0.001;与1 μmol/L相比,#P<0.05,##P<0.01;与3 μmol/L相比,&P<0.05,&&P<0.01

3 讨论

胃癌是全球主要的健康威胁,是仅次于肺癌的第二大癌症相关死亡原因。虽然早诊率有所提高,但由于术后复发、获得性耐药、晚期转移等原因[3],胃癌的治疗效果仍不理想。寻找新的药物来治疗胃癌成为科研工作者研究的热点。去甲泽拉木醛是从雷公藤中提取的一种新型三萜类单体,具有广泛的药理作用。虽然已知它与乳腺癌[14]、胶质瘤[15]和恶性黑色素瘤[16]有关,但还需要进一步的研究来确定它是否具有广谱的抗肿瘤作用。

本研究的主要目的是探讨去甲泽拉木醛对胃癌细胞的抗癌作用。为此在体外进行了一系列实验探讨去甲泽拉木醛对胃癌细胞的作用及相关机制。由CCK-8细胞毒性实验及克隆形成实验的结果可知,去甲泽拉木醛对胃癌AGS细胞具有明显的细胞毒性和增殖抑制作用,且呈浓度依赖性。除此之外,去甲泽拉木醛还可以抑制胃癌AGS细胞的迁移并诱导细胞凋亡。

细胞凋亡是一种程序性死亡,由线粒体介导的内源性途径和死亡受体介导的外源性途径共同驱动[17]。而且这一复杂的机制涉及许多信号通路。半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspases)是细胞凋亡机制的核心,因为它们既是细胞死亡的启动者,又是细胞死亡的执行者[18]。一旦被激活,作为启动者的Caspases就会分裂执行身份的Caspases,对特定的细胞底物进行切割,最终导致细胞凋亡[19]。Caspase-9在一个内部的线粒体依赖通路中被激活,进而导致Caspase-3的激活[20],活化后的Caspase-3可以触发下游物质PARP的裂解[21],导致染色质裂解,最终导致细胞凋亡[22]。本研究的结果与上述报道一致,表明去甲泽拉木醛可能是通过Caspase级联反应的激活来诱导胃癌AGS细胞凋亡。然而越来越多抗肿瘤的研究不仅针对细胞凋亡展开,细胞增殖、迁移等也是抗肿瘤不可或缺的靶点,包含JNK、ERK和P38在内的MAPK蛋白激酶信号通路在细胞增殖、生存和凋亡中发挥重要作用[23]。目前,ERK 1/2是细胞增殖的关键调控因子,磷酸化后的ERK1/2转移到细胞核,激活多种转录因子包括c-Myc、NF-κB和CREB,进而调节细胞凋亡、增殖和生存等一系列生物过程[24,25]。因此,ERK通路的抑制剂已在临床试验中被用作潜在的抗癌药物[26]。而本实验Western blot结果表明去甲泽拉木醛能够下调p-ERK1/2蛋白的表达,从而进一步影响胃癌AGS细胞的凋亡和增殖。

综上所述,本研究结果显示,去甲泽拉木醛具有抑制胃癌AGS细胞增殖、迁移和诱导凋亡的作用,其机制可能与Caspase级联反应的激活和ERK1/2通路的下调有关。本研究为去甲泽拉木醛的开发及胃癌的治疗提供了参考价值,但详细机制还有待于进一步的实验证明。