华南地区猪群猪流感病毒病原学和血清学调查

付新亮，方 博，蔡孟楷，黄俊明，卜德新，张桂红*

（1. 仲恺农业工程学院 动物科技学院，广东 广州 510225；2. 华南农业大学 兽医学院，广东 广州 510642；3. 广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室，广东 广州 510642）

猪流感（Swine influenza，SI）是由猪流感病毒（Swine influenza virus，SIV）引起猪的一种急性呼吸道传染病。由于猪的呼吸道既有SA α-2,3-Gal 唾液酸受体，又有SA α-2, 6-Gal 唾液酸受体分布[1]，猪的这种受体分布特性使得其既可以感染禽流感病毒（AIV），又可以感染人流感病毒，进而在猪体内产生新的重组病毒，因此猪被称为流感病毒的“混合器”[1]，在流感病毒“禽-猪-人”的传播链中发挥着重要作用，具有重要的公共卫生学意义。目前在猪群中流行的SIV主要有H1N1、H1N2和H3N2 3种亚型，其中H1 亚型SIV 又分为经典猪流感（Classical Swine H1N1，CS）、欧亚类禽（Eurasian-avian like，EA）、pdm09和人季节性流感（Human-like）分支[2-3]，而欧亚类禽分支SIV已经成为猪群中的优势病毒株[4]。为了解和掌握华南地区猪群中SIV 的流行及其变异、重组和遗传演化规律等，本研究从病原学和血清学两个方面对2016年～2017年华南地区猪群开展流行病学调查，以期为SIV 的防控和疫苗株的筛选提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集与病毒株 猪肺脏病料组织236 份，猪鼻拭子样品143 份采集自2016 年～2017 年华南地区猪场；3 265 份血清样品采集自华南地区猪场中未免疫SI 疫苗猪群，并对血清采集时间进行统计，用于SIV 流行的季节性特点分析。甲型H1N1pdm09 分支[A/Guangdong/1057/2010（pdm09 H1N1）]，欧亚类禽猪 流 感 分 支[A/swine/Guangdong/SS1/2012（EA H1N1）]，H3N2 亚 型SIV[A/swine/Guangdong/L22/2010（H3N2）]，H9N2 亚 型AIV Beijing-94 like 分 支[A/chicken/Guangdong/V/2008（H9N2）]，H5N1 亚 型AIV 2.3.2.1 分 支[A/chicken/Guangdong/178/2004（H5N1）]， H7N9 亚型AIV[A/chicken/Guangdong/G2/2013（H7N9）]等血清学调查所用病毒株，其中H1N1 和H3N2 亚型SIV 由本实验室分离保存，H9N2、H5N1 和H7N9 亚型AIV由华南农业大学禽病教研室廖明教授和亓文宝教授惠赠。

1.2 主要试剂 TRIzol RNA 提取试剂购自Thermo-Fisher 公司；M-MLV 反转录酶、PrimeStar HS DNA Polymerase、pMD18-T、DL2000 DNA Marker 和DNA凝胶回收试剂盒均购自TaKaRa 公司；E. coli DH5α感受态细胞购自天根生化科技有限公司；RDE 受体破坏酶购自日本生研公司。

1.3 病毒分离及鉴定 病料组织经研磨后4 ℃离心取上清，鼻拭子样品置于DMEM培养基中经震荡混匀后离心取上清。利用TRIzol 法提取病料组织和鼻拭子样品总RNA，反转录为cDNA 后通过流感病毒M 基因检测引物进行PCR 检测[3]。经PCR 鉴定为阳性的样品接种SPF鸡胚进行PCR病毒分离，并进行血凝试验鉴定。

1.4 病毒分离株分子特征分析及遗传演化分析 利用流感病毒8 个节段特异性引物对病毒分离株进行全基因组扩增[3]，PCR 扩增产物回收后连接至pMD18-T 载体，由华大基因测序。应用DNAStar 分析软件对病毒分离株8 个基因节段进行序列比对分析、核苷酸和氨基酸同源性分析及分子特征分析，并利用MEGA5.0对8个基因节段构建遗传进化树，进行遗传演化分析。

1.5 血清抗体测定及统计分析 将3 265 份待检血清样品分别与RDE 酶按1∶4 比例混合，37 ℃孵育过夜，置于56 ℃灭活30 min，以去除血清中的非特异性凝血因子。通过HI 试验测定血清样品中H1N1、H3N2 亚型SIV 及H9N2、H5N1 和H7N9 亚型流感病毒的抗体滴度[5]，HI效价大于或等于1∶40 时，判定为血清样品HI 抗体阳性。通过GraphPad Prism 和SPSS 软件对猪群中不同亚型流感病毒的血清阳性率、血清抗体滴度（几何平均滴度±标准差）、混合感染情况及季节性流行特点进行统计分析。

2 结 果

2.1 病毒分离鉴定 从236 份肺脏组织样品和143份鼻拭子样品中通过RT-PCR 方法共检测到3 份流感病毒阳性样品，接种鸡胚和细胞后分离得到3 株SIV，分别命名为A/Swine/Guangxi/NK/2016、A/Swine/Guangdong/ZSBS/2017 和A/Swine/Fujian/NP/2017。对3个分离株分别进行全基因组测序，并对其HA 和NA基因进行BLAST 比对分析，结果显示3 个分离株均与H1N1 亚型流感病毒同源性最高，表明3 株SIV 均为H1N1 亚型。

2.2 病毒分离株同源性和分子特征分析 3 个病毒分离株HA 蛋白氨基酸同源性约为96.6%～97.9%，与H1 亚型SIV 参考株中的欧亚类禽病毒株同源性最高，其同源性约为89%～98.4%；3 个病毒株NA 蛋白的氨基酸同源性约为94.9%～96.6%，同样与欧亚类禽病毒株同源性最高。对HA蛋白分子特征分析结果显示，A/Swine/Fujian/NP/2017 和A/Swine/Guangdong/ZSBS/2017与其它欧亚类禽病毒株一样，在HA蛋白的第10、11、23、195、274、481和540位有7个潜在的糖基化位点，而A/Swine/GuangXi/NK/2016在第23位糖基化位点发生了缺失。3 个分离株HA 蛋白在第216、222 和224 位分别为Ala、Glu 和Ala，表现出偏向结合禽类α-2,3受体的特性，其HA蛋白裂解位点处的氨基酸序列均为PSIQSR↓GLT，无碱性氨基酸的插入，呈现低致病性的特性。对PB1 蛋白的分子特征分析结果显示，3 个病毒株PB1 蛋白与pdm09 株一样发生了Leu473Val 突变，经典猪流感和人季节性流感分支的病毒株在473 位为Leu，而PB1 蛋白Leu473Val 突变可增强流感病毒在哺乳动物细胞中的复制能力。

2.3 病毒分离株遗传演化和重组分析 HA 和NA基因遗传演化分析结果显示，3个分离株的HA和NA基因均位于欧亚类禽分支，与近几年国内的分离株遗传进化关系较近（图1），HA 和NA 基因遗传演化分析结果与氨基酸同源性分析结果相符。其它6 个基因（PB2、PB1、PA、NP、M和NS基因）遗传演化分析结果显示，3个分离株的PB2、PB1和PA基因、A/Swine/GuangXi/NK/2016的NP和M基因、A/Swine/Guangdong/ZSBS/2017 的M 基因、A/Swine/Fujian/NP/2017 的NP 基因均属于pdm09 分支；A/Swine/Guangdong/ZSBS/2017的NP 和NS 基 因 以 及A/Swine/Fujian/NP/2017 的M 和NS 基因均属于欧亚类禽分支，而A/Swine/GuangXi/NK/2016 的NS 基因属于经典猪流感分支（图略）。

图1 HA（A）和NA（B）基因遗传演化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of HA(A)and NA(B)gene

对3 个病毒株8 个基因节段的遗传演化分析结果显示，A/Swine/Fujian/NP/2017 由欧亚类禽、pdm09 和经典猪流感3个不同分支重组而来，而A/Swine/Guangdong/ZSBS/2017 和A/Swine/Fujian/NP/2017 由 欧 亚 类 禽和pdm09 重组而来（图2），表明SIV 欧亚类禽分支病毒株与pdm09 株之间的重组现象已经非常普遍。

图2 病毒分离株基因重组示意图Fig.2 The diagram of gene reassortment for SIV identified strains

2.4 猪群中流感病毒血清抗体监测结果 利用HI试验对2016 年7 月～2017 年6 月间从华南地区猪群采集的3 265 份血清样品进行SIV 抗体检测，检测所用的抗原类型包括H1N1（EA 分支和pdm09 分支）、H3N2、H9N2、H5N1 和H7N9 亚型，各亚型的血清抗体阳性率如表1 所示。EA H1N1、pdm09 H1N1 和H3N2 SIV 的血清抗体阳性率分别为27.53%（899份）、20.98%（685 份）、34.85%（1138 份），其中H3N2 亚型SIV 血清抗体阳性率最高（p＜0.01），其次是欧亚类禽分支。另外，还检测到21 份血清样品呈H9N2 亚型抗体阳性，阳性率为0.64%，但H5N1 和H7N9 抗体均为阴性。猪群中不同亚型和不同分支SIV 之间混合感染的情况也很普遍，其中EA H1N1 和pdm09 之间以及EA H1N1 和H3N2 SIV 之间混合感染率较高，分别为11.3%（369 份）和10.01%（327 份）。另外，还有4.65%（152 份）的血清样品可以同时检测到EA H1N1、pdm09 和H3N2 3 种SIV 的抗体。表明H1N1和H3N2 亚型SIV 在华南地区猪群中的流行及混合感染情况较为严重。

表1 不同亚型SIV HI 抗体检测结果Table 1 HI titer of different subtype SIV in swine serum samples

2.5 不同亚型流感病毒HI 抗体滴度分布 统计各亚型HI 抗体滴度的分布情况，并通过GraphPad Prism 软件绘制HI 抗体滴度分布图，计算其几何平均滴度（GMT）和标准误差，结果如图3 所示。EA H1N1、pdm09 和H3N2 亚 型SIV HI 抗 体 的GMT 分 别为118.2±9.8（95%CI:110.7～126.2）、139.9±12.7（95%CI: 128.8～152）和138.6±5.9（95% CI: 132.1～145.3），H9N2 亚型HI 抗体的GMT 为77.4±3.4（95% CI: 58.9～101.7）。其中EA H1N1、pdm09 和H3N2 亚型SIV HI抗体滴度最高均可达到1∶1 280，而H9N2 亚型HI 抗体滴度最高为1∶160。表明H9N2 AIV 虽然可以感染猪，但对猪还不适应。

图3 不同亚型流感病毒血清HI 抗体滴度分布情况Fig.3 The distribution of HI titer for different subtype SIV

2.6 SIV 季节性流行特点分析 为了解SIV 的季节性流行特点，本研究对不同亚型或分支SIV 在一年中各月份的血清抗体阳性率进行了统计，结果显示，3 种SIV 的血清抗体阳性率从9 月或10 月份开始升高，到12 月份或1 月份，血清抗体阳性率达到最高水平。其中EA H1N1 SIV 在12 月份阳性率最高，达到34.72%，pdm09 H1N1 和H3N2 亚型SIV 的血清抗体阳性率均在1 月份达到最高，分别为29.15%和46.53%，随后血清抗体阳性率明显降低（图4）。表明SIV 的流行具有季节性，并且在冬季（11 月、12月和1 月份）的流行最为严重。

图4 3 种SIV 季节性流行特点分析Fig.4 Seasonal epidemic feature analysis of three different SIV

3 讨 论

自2009 年pdm09 H1N1 甲型流感病毒在人群中暴发后，许多国家和地区陆续从猪群中检测到该型病毒或者该病毒的特异性抗体[6-9]。随后pdm09 H1N1甲型流感病毒开始在猪群中稳定下来，并在世界范围内的猪群中持续传播[10]。此后，pdm09 H1N1 与经典猪流感、欧亚类禽分支和H3N2 SIV 一起在猪群中共同流行[11]，并且pdm09 H1N1 与其它SIV 不断发生重组，产生新的重组病毒株。朱华晨等在2011 年首次从猪群中分离到pdm09 H1N1 和欧亚类禽分支SIV间的重组病毒，该重组病毒的表面基因来源于欧亚类禽分支，而内部基因来源于pdm09 H1N1 SIV[12]。进一步研究证实，该重组病毒可以在猪群之间高效传播，并且可以从猪传播至雪貂，表明该重组病毒有从猪传播给人的潜在威胁[12]。除了pdm09 H1N1 与H1N1亚型SIV 之间的重组外，也有H3N2 亚型SIV 与pdm09 H1N1 SIV 重组的报道，并且重组病毒对猪的致病性以及在猪群之间的传播能力也显著增强[13-14]。

本研究从华南地区猪群采集的肺脏组织和鼻拭子样品中分离鉴定到3 株SIV，全基因组测序和遗传演化分析结果显示3 个分离株均为H1N1 亚型，其HA 和NA 基因均属于欧亚类禽病毒株，也证实了欧亚类禽分支SIV 是目前我国猪群中的主要流行株[4]。另外，本研究中的3 个分离株均与pdm09 H1N1 SIV发生了重组，证实了华南地区猪群中欧亚类禽分支SIV 与pdm09 H1N1 SIV 之间的重组现象非常普遍，并且相关研究表明，欧亚类禽分支SIV 与pdm09 H1N1 SIV 的重组病毒株在猪群之间的传播能力明显增强[12]。因此，需要加强对猪群中SIV的变异及其重组的监测，为其跨宿主传播提供相应的预警，并展开相关疫苗的研发，为猪群中SI的防控提供帮助。值得注意 的 是，A/swine/Guangxi/NK/2016 的HA 蛋 白 第23 位的糖基化位点发生了缺失，而糖基化位点与流感病毒的传播能力、抗原性、病毒毒力以及逃避宿主的免疫应答有关[15]，而该病毒株糖基化位点的缺失对病毒生物学特性的影响还需要进一步研究。

另外，本研究还测定了华南地区猪群中H1N1、H3N2、H9N2、H5N1 和H7N9 这5 种亚型流感病毒的血清抗体阳性率，其中H3N2 亚型SIV 的抗体血清抗体阳性率最高，该结果与之前的研究报道相符[16]。相关研究报道H9N2亚型SIV可以感染猪，并可以通过鼻分泌物向体外排毒，以及引起血清抗体转阳[17]。本研究从华南地区猪群血清中也检测到H9N2 亚型流感病毒的抗体，虽然血清抗体阳性率较低，仅为0.64%（21 份），但证实了华南地区猪群中存在有H9N2 亚型流感病毒感染猪的情况。虽然有零星的关于H5N1 亚型流感病毒感染猪的报道[18]，但在本研究中未检测到H5N1 和H7N9 亚型流感病毒的特异性抗体。另外，血清抗体检测结果显示，猪群中不同亚型和不同分支SIV 之间混合感染的情况也非常普遍。通过对不同亚型SIV 在一年中各月份的血清抗体阳性率进行统计，显示SIV 在猪群中的流行具有一定的季节性，主要在冬季（11 月、12 月和1 月份）的流行最为严重。本研究可为华南地区猪群SI防控和疫苗株的筛选提供参考依据。