迟缓爱德华菌FliC-TolC 融合蛋白表达及免疫特性研究

张志强，杜万年，王 苗，于秀剑，田占云，刘 晨，李昕甜，吴同垒，康元环，史秋梅*，刘 莉

（1. 浙江省淡水水产研究所 农业部淡水渔业健康养殖重点实验室/浙江省鱼类健康与营养重点实验室，浙江 湖州 313001；2.河北省预防兽医学重点实验室河北科技师范学院，河北 秦皇岛 066004；3.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118）

迟缓爱德华菌（Edwardsiellatarda），为肠杆菌科爱德华菌属成员，能够感染多种海洋鱼类和陆生动物，引起包括败血症在内的多类型感染，已成为我国经济鱼类养殖的重要病害之一[1]。

TolC 是存在于革兰氏阴性菌外膜中的通道蛋白，较为保守，在细菌应对外界不利环境时发挥重要作用[2-5]。对沙门菌的研究表明，TolC 蛋白作为免疫原对沙门菌感染的动物具有优良的保护效果[6]。本研究室前期对E. tarda 的TolC 蛋白进行相应研究发现，重组TolC 蛋白免疫小鼠具有优良的免疫保护效果（实验数据未发表）。而鞭毛蛋白FliC 在细菌运动、黏附和侵染宿主过程中发挥重要作用[4,7]，是细菌的重要毒力因子[5]。对鼠伤寒沙门菌的研究显示，鞭毛蛋白是引起免疫反应的重要抗原成份之一[7]，同时鞭毛蛋白可以通过TLRS 通路诱导炎症反应并促使树突状细胞成熟，增加抗原的递呈效率，起到免疫佐剂的作用[7-8]。本实验室前期对E. tarda 鞭毛蛋白FliC 的研究显示，该蛋白具有较强的免疫原性和疫苗佐剂的特性[9]。那么将E. tarda 鞭毛蛋白FliC 与外膜蛋白TolC 融合表达，利用融合产物免疫动物是否具有更好的免疫效果？为此，本研究采用原核表达系统，对E. tarda 鞭毛蛋白FliC 与外膜蛋白TolC 进行融合表达，并评价其免疫效果，探索FliC-TolC 作为疫苗应用的潜力。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒和实验动物 致病性E. tarda ET-13分离株（哺乳动物源）由东南大学高大庆教授惠赠；ET-10 分离株（牙鲆源）、纯化的E. tarda TolC 蛋白360 μµg/mL、FliC 蛋 白640 μµg/mL、pET-28a 原 核表达载体由河北省预防兽医学重点实验室保存；E.coli DH5α、E.coli BL21感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。6 周龄～8 周龄清洁级昆明小鼠，购自中国医学科学院实验动物研究所，在本实验室自由采食1周，以适应环境。3 cm～5 cm斑马鱼购自秦皇岛某花鸟市场，于实验室养殖2周，以适应环境。

1.2 主要试剂 LATaq DNA 聚合酶购自TaKaRa 公司；BamHⅠ、SalⅠ及T4 连接酶均购自Thermo 公司；细菌基因组DNA 提取试剂盒、His 标签单克隆抗体（His-MAb）、山羊抗小鼠IgG-HRP 抗体（HRP-IgG）、eECL Western Blot Kit、IPTG 及Ni-Agargose Resin 购自康维世纪公司；质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒购自OMEGA 公司。

1.3 引物设计与合成 根据GenBank 登录的E.tarda 参考菌株ET-1 基因组序列（CP001135.1）设计特异性引物扩增fliC-tolC 片段（表1）。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 PCR 扩增所用引物Table 1 The primer sequences for PCR amplification

1.4 重组原核表达载体的构建与鉴定 提取ET-10基因组，以其为模板，利用P1/P2、P3/P4，分别扩增fliC、tolC 基因片段；琼脂糖凝胶电泳检测后，回收特异性基因片段。将回收产物1∶100 稀释后，按1∶1 摩尔比混合后作为融合PCR 模板，利用P1/P4 引物进行融合PCR，回收目的基因片段。目的片段经BamHⅠ、SalⅠ双酶切后克隆至pET-28a 载体中，构建重组质粒pET-28a-fliC-tolC。重组质粒经PCR鉴定，并由上海生工生物工程技术服务有限公司测序鉴定。

1.5 重组FliC-TolC 融合蛋白的表达验证、可溶性分析及纯化 将鉴定的pET-28a-fliC-tolC 重组质粒和空载体，分别转化入E.coli BL21（DE3）感受态细胞中培养至OD600nm值为0.6～0.8；加入IPTG（至终浓度为1 mmol/L），37 ℃继续诱导培养4 h；制备蛋白样品[10]，以His-MAb 为一抗（1∶10 000），山羊抗小鼠IgG-HRP（1∶20 000）为二抗，利用eECL western blot kit 鉴定目的蛋白的表达。

对重组菌株大体积诱导培养，超声破碎菌体后分别收集上清液和沉淀。将诱导后菌液、超声裂解上清液、超声裂解沉淀分别制备蛋白样品，经SDS-PAGE 检测，分析目的蛋白的表达情况及表达形式。按Ni-Agargose Resin 蛋白纯化说明纯化目的蛋白[11]，利用BCA 蛋白浓度测定试剂盒，测定目的蛋白纯化浓度，于-70 ℃保存。

1.6 免疫小鼠血清抗体水平的检测 参照文献[12-13]利用小鼠模型评价FliC-TolC 蛋白的免疫效果。将健康昆明鼠随机分成4 组，每组20 只。以纯化的FliC-TolC、FliC、TolC 重组蛋白作为免疫原，免疫剂量分别为20 g/只、100 g/只、100 g/只。分别于第0、15 d、22 d 免疫，对照组为等体积PBS，将重组蛋白或PBS 添加一定比例的吐温-80 和白油后乳化；乳化蛋白以颈背部皮下进行分点注射免疫。

在小鼠免疫后0 、15 d、22 d、29 d，尾尖采血并分离血清。利用间接ELISA[12-13]，以超声破碎的E.tarda 全菌蛋白作为包被抗原[14]，检测小鼠血清中抗体水平，以阴性血清OD450nm平均值+3SD 作为阴阳性临界值，OD450nm值大于临界值判定为阳性。

1.7 小鼠免疫保护实验 三免后15 d 对全部小鼠腹腔接种ET-13 菌液，剂量为2 LD50（8.0×106cfu），感染后观察96 h，统计各组小鼠死亡情况并计算攻毒保护率。

1.8 斑马鱼免疫保护实验 利用斑马鱼模型评估重组FliC-TolC、FliC、TolC 蛋白对E.tarda 感染的免疫保护效果。将健康斑马鱼随机分成4 组，每组20尾。将重组蛋白肌肉注射斑马鱼，每尾50 g，对照组注射等体积PBS；首免后第15 d 对实验组斑马鱼腹腔接种感染ET-10，剂量为2 LD50（2×106cfu），感染后观察4 d，统计各组斑马鱼攻毒死亡情况，计算攻毒保护率。

2 结 果

2.1 重组原核表达载体的构建与鉴定 以ET-10 基因组为模板经PCR 分别扩增fliC、tolC 基因片段，结果显示在1 000 bp、1 200 bp 处出现目的条带，与预期一致（图1）；二次融合PCR 在2 000 bp 处扩增出与预期大小一致的目的基因片段。将目的基因片段双酶切后克隆至pET-28a 载体中，测序无突变和移码，即得到重组表达载体pET-28a-fliC-tolC。

图1 E.tarda 靶基因的PCR 扩增Fig.1 Amplification of the target genes from the genome of E.tarda by PCR

2.2 重组FliC-TolC融合蛋白的表达检测、可溶性分析及纯化 将重组载体pET-28a-fliC-tolC 转化E.coli BL21（DE3）后诱导表达，SDS-PAGE 分析融合蛋白表达情况，结果显示在78 ku 处出现目的蛋白条带，而诱导的空载体菌体均无此蛋白条带（图2A）。Western blot 分析结果显示，同样于78 ku 处出现特异性条带（图2A），表明FliC-TolC 重组融合蛋白正确表达。

对FliC-TolC 融合蛋白进行可溶性分析，SDSPAGE 分析结果显示，菌体蛋白上清中出现较浓的特异蛋白质条带，而沉淀中的重组蛋白含量比较低（图2B），表明FliC-TolC 蛋白主要以可溶性表达。利用Ni-Agargose Resin 试剂盒纯化得到纯化FliCTolC 蛋白，测定FliC-TolC 蛋白浓度为66μµg/mL。

2.3 免疫小鼠血清抗体水平的检测 将纯化的FliCTolC、TolC、FliC 蛋白免疫小鼠，将4 次采集的血清按1∶200 稀释后，采用间接ELISA 方法检测特异性抗体水平。结果显示，在免疫15 d 时，FliCTolC、TolC 蛋白免疫组抗体达到较高水平，而FliC蛋白免疫组略低于两组；在免疫22 d 时，FliC-TolC蛋白免疫组产生特异性抗体明显高于TolC 和FliC 蛋白免疫组（图3）。表明FliC-TolC 蛋白具有良好的免疫原性。

图2 FliC-TolC 蛋白表达的检测（A）及可溶性分析（B）Fig.2 FliC-TolC protein expression and solubility analysis

图3 免疫小鼠的抗体检测结果Fig.3 Results of antibody titer detection in immunized mice

2.4 小鼠模型免疫保护实验 将纯化的FliC-TolC、TolC、FliC 蛋白免疫小鼠，并于3 免后15 d 对所有小鼠以2 LD50ET-13 活菌腹腔攻毒，96 h 内观察并记录每组小鼠的死亡情况。结果显示：对照组小鼠相继全部死亡，FliC-TolC、TolC、FliC 3 个蛋白免疫组小鼠，免疫保护率分别为95%、95%和65%（图4）。表明FliC-TolC 融合蛋白对小鼠具有较好的免疫保护力。

2.5 斑马鱼模型免疫保护实验 将纯化的FliCTolC、TolC、FliC 蛋白肌肉注射免疫斑马鱼，于第15 d，以2 LD50ET-10 感染斑马鱼。结果显示：对照组斑马鱼全部死亡，FliC-TolC、TolC、FliC 3 个蛋白免疫组均能够在不同程度上保护斑马鱼免受E.tarda 感染。免疫保护率分别为60%、45%和30%（图5）。表明重组FliC-TolC 融合蛋白能够在一定程度上保护斑马鱼对抗E. tarda 感染。

图4 FliC-TolC 蛋白对小鼠的免疫保护率Fig.4 Immune protection rate of FliC-TolC protein in mice

图5 FliC-TolC 蛋白对斑马鱼的免疫保护率Fig.5 Immune protection rate of FliC-TolC protein in zebrafish

3 讨 论

本研究利用融合PCR 方法扩增fliC-tolC 基因融合片段，进而构建表达载体。扩增结果显示，该方法虽然会出现非特异性扩增，但经胶回收后，产物完全能够满足后续试验要求，同时该方法能够避免酶切位点的限制，能够较好的实现片段融合。

在设计FliC-TolC 融合表达时，本研究尝试将fliC、tolC 开放阅读框相连，构建表达载体后，虽无移码和突变，但融合蛋白并未表达（SDS-PAGE 和western blot 数据未展示），推测是FliC、TolC 发生了相互干扰，影响了融合蛋白表达。因此，本研究在设计扩增融合基因时在两个基因间插入了linker（GGGGS）的编码基序，结果显示，蛋白得到有效表达。

本实验显示所获得的融合蛋白在上清表达，但在利用针对可溶性蛋白的Ni-Agargose Resin 试剂盒纯化蛋白时，未能回收到纯化的蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳显示（图略），蛋白存在于流穿液中，未能与Ni-Agargose Resin 结合。分析原因，可能是FliC 与TolC 蛋白在折叠过程中将His 标签包裹起来。为此，本研究向上清中添加终浓度为8 mol/L 的尿素后纯化，得到了纯化蛋白。

本实验室前期研究分别利用FliC 与TolC 蛋白免疫小鼠均展现良好的免疫效果[9]，其中TolC 蛋白免疫保护率可达95%。为了评价FliC-TolC 融合蛋白免疫效果，并比较其与单纯TolC 蛋白和FliC 免疫差异，本研究降低了免疫蛋白剂量为20 g/只，结果显示，FliC-TolC 融合蛋白免疫小鼠能够产生较高水平抗体，明显高于TolC 免疫组和FliC 免疫组。

本实验利用动物模型对E. tarda FliC-TolC 融合蛋白免疫效果进行了进一步研究。E.tarda 是人兽共患病原，小鼠是其模式动物，因此首先测定了FliC-TolC、FliC、TolC 3 个蛋白对小鼠的免疫保护力，结果显示，FliC-TolC 融合蛋白免疫保护力较高达到95%，也明显高于TolC 免疫组和FliC 免疫组小鼠。与此同时，本研究利用斑马鱼模型进行了平行试验，得到了类似的结果，融合蛋白对斑马鱼的免疫保护率为60%，高于TolC 免疫组和FliC 免疫组。

E.tarda 鞭毛蛋白FliC 与外膜蛋白TolC 均是该菌具有较好免疫保护效果的蛋白，其中鞭毛蛋白FliC兼具疫苗佐剂的特性[15]。本研究构建了E.tarda FliCTolC 融合蛋白，并对其免疫效果进行评价，证实了该融合蛋白能够诱导高水平的体液免疫，对实验动物具有优良的免疫保护效果，为进一步研制E.tarda亚单位苗和活载体疫苗提供了参考。