类风湿关节炎血液和关节滑膜液淋巴细胞中CCR1的表达及临床意义

马衍慧，章建峰，刘丽敏

（1.湖州市中医院，浙江 湖州 313000；2.湖州市第三人民医院，浙江 湖州 313000）

类风湿关节炎（RA）的临床过程涉及多个因子[1]，其中趋化因子与RA的发生发展最紧密，付迪等[2]的研究表明，沙立度胺用于类风湿关节炎控制病情和临床症状的同时可降低趋化因子配体19水平，任春凤等[3]研究表明，基质细胞衍生因子-1α/趋化因子受体4信号转导通路和IL-8与类风湿关节炎的发生发展相关。本文关注RA和血液、关节滑膜液淋巴细胞中趋化因子CCR1的表达，并分析其与病情、预后的关系，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2018年2月-2019年3月湖州市中医院（33例）和湖州市第三人民医院（27例）收治的RA患者60例为RA组，均符合RA诊断标准[4]。排除标准：（1）入组前3个月内经糖皮质激素治疗者；（2）合并全身重要脏器功能障碍患者或全身感染性疾病、血液系统疾病、其他自身免疫性疾病患者；（3）因各类原因无法配合完成相关治疗和检查者。另选择30例同期体检健康者（湖州市中医院和湖州市第三人民医院各15例）为健康组。研究经医院伦理委员会审批通过且患者知情同意。两组性别、年龄、体质量指数一般资料比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。 详见表 1。

表1 两组一般资料比较

1.2 治疗方法 参照中华医学会风湿病学分会2018中国类风湿关节炎诊疗指南[5]进行治疗，RA患者均接受常规治疗，包括非甾体类药物抗炎、抗风湿药物、糖皮质激素治疗等，有手术指征者进行相关手术治疗，治疗期间均行饮食指导和护理，严重者进行关节制动并卧床休息，情绪异常者进行相应的心理护理干预。

1.3 观察指标与检测方法 （1）CCR1水平。血液CCR1水平：于健康组入选次日和RA组治疗前以及治疗1、3个月时，取空腹静脉血于EDTA抗凝管中，摇晃混匀，以3500r/min转速和3cm半径在4℃环境中离心5分钟，待分层后弃上层血清，下层血浆冷藏于-20℃低温冰箱冷藏待测，ELISA法检测血浆CCR1表达水平，检测仪器采用瑞士帝肯Infinite F50酶标仪，试剂盒均购自上海瑞奇生物技术有限公司，操作按说明书指导。RA组关节滑膜液CCR1水平：RA组治疗前以及治疗1、3个月时取关节滑膜液，肝素抗凝，离心条件同血液标本，离心后弃上清液，PBS重悬，Ficoll淋巴细胞分离并将淋巴细胞浓度调至 1×106/mL，PCR检测关节滑膜液淋巴细胞中CCR1 mRNA表达水平，常规提取待检测样本总RNA，逆转录合成cDNA后冷冻保存，通过PCR简易快速试剂盒进行RT-PCR反应，其中CCR1上游引物为 5’-AGACTTCACGGACAAAGTCC-3’，下游引物为 5’-TGATCACACTTGTCACCACC-3，扩增长度 500bp，GADPH 上游引物为 5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物为 5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’，扩增长度 500bp，以 cDNA 为模板，根据PCR试剂盒步骤进行扩增，扩增反应条件为94℃预变性2分钟，94℃变性40秒，CCR1 54℃退火40秒，GADPH 56℃退火40秒，72℃延伸1分钟，共32个循环胡，72℃延伸5分钟，行产物鉴定，5μL产物上2%琼脂凝胶电泳鉴定后EB染色并在紫外检测仪上观察，凝胶成像系统扫描分析目的条带灰度，与GADPH条带灰度值表达CCR1相对灰度值。（2）病情与预后。RA组治疗前以及治疗1、3个月时，采用关节疼痛视觉模拟评分（VAS）[6]和RA疾病活动性评分（DAS 28评分）[7]进行病情和预后评价。其中VAS评分0-10分，分数越高表明疼痛程度越严重；DAS 28评分评估每个关节的限制程度，DAS 28＜2.6为疾病缓解，≥2.6～3.2为轻微疾病活动，≥3.2～5.1为中度疾病活动，≥5.1为重度疾病活动。

1.4 统计学处理 采用SPSS 24.0软件处理数据，计数资料用百分率表示，采用χ2检验；计量资料用（±s）表示，采用独立样本 t检验，多组计量资料的均数比较采用方差分析，Pearson线性相关分析法分析RA组血液和关节滑膜液淋巴细胞中CCR1表达水平与VAS评分、DAS 28评分的关系。

2 结果

2.1 CCR1表达 治疗前RA组血液CCR1表达水平较健康组升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与同组治疗前比较，RA组治疗1、3个月的血液和关节滑膜液淋巴细胞中CCR1表达水平均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表2。

表2 RA患者治疗前后CCR1表达情况（±s）

表2 RA患者治疗前后CCR1表达情况（±s）

与治疗前比较*P＜0.05

关节滑膜液淋巴细胞CCR1 mRNA治疗前 3.75±0.85 0.842±0.218治疗 1 个月 1.63±0.58* 0.522±0.126*治疗 2 个月 1.27±0.36* 0.386±0.087*时间 血液CCR1（ng/mL）

2.2 病情与预后 与治疗前比较，RA患者治疗1、3个月的VAS评分和DAS 28评分均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。 详见表 3。

表3 RA 患者病情变化（±s，分）

表3 RA 患者病情变化（±s，分）

与治疗前比较*P＜0.05

时间 n VAS评分 DAS 28评分治疗前 60 7.96±1.25 5.63±1.03治疗 1 个月 60 3.85±0.84* 3.82±0.36*治疗 3 个月 60 2.28±0.65* 3.18±0.22*

2.3 相关性分析 Pearson线性相关分析结果显示，RA组血液CCR1表达水平与VAS评分、DAS 28评分均呈正相关（r=0.843，r=0.881，P＜0.05）；RA 组关节滑膜液淋巴细胞中CCR1表达水平与VAS评分、DAS 28 评分均呈正相关（r=0.826，r=8.93，P＜0.05）。

3 讨论

类风湿关节炎的病因目前尚不明确，是多种因素导致的自身免疫反应，侵蚀性滑膜炎是类风湿关节炎的主要病理特点[8]，而趋化因子在炎症细胞滑膜浸润中具有重要的定向作用，在趋化因子及其配体共同作用下可引导关节滑膜的炎症细胞浸润，影响病情进展。已有研究表明，趋化因子在类风湿关节炎患者关节滑膜液中水平的异常升高[9-10]。CCR1是与炎症密切相关趋化因子受体，而巨噬细胞炎性蛋白1α以及RANTES作为其主要配体均是有效的细胞趋化剂，与机体炎症相关。同时，国外有研究表明，CCR1拮抗剂可干预类风湿关节炎[11-12]。因此，明确CCR1在类风湿关节炎中的作用机制及CCR1拮抗干预措施对提高类风湿关节炎防治水平具有重要意义。本文结果显示，相对于健康人群，类风湿关节炎患者血液CCR1表达水平出现了明显的升高，提示CCR1可能与类风湿关节炎发生发展相关。经治疗后，类风湿关节炎患者的血液和关节滑膜液淋巴细胞中趋化因子CCR1的表达水平逐渐降低，与此同时，疼痛症状及病情缓解，血液和关节滑膜液淋巴细胞中趋化因子CCR1表达水平与类风湿关节炎病情同步改善。相关性分析显示，类风湿关节炎血液和关节滑膜液淋巴细胞中CCR1表达水平与其VAS评分、DAS 28评分均呈正相关，表明CCR1可评估RA病情及预后。

综上所述，CCR1在RA血液和关节滑膜液淋巴细胞中高表达，并可用于其病情和预后评估。