不同盐度和碱度对卡拉白鱼精子活力和受精率的影响

王信海,姜爱兰,蔺玉华,吴学军

(江苏省农业科学院 宿迁农科所,江苏 宿迁 223800)

卡拉白鱼(Chalcalburnuschalcoidesaralensis)隶属鲤科、雅罗鱼亚科、卡拉白鱼属[ 1],具有肉质细嫩、味鲜美,抗病性强和耐盐碱等优良性状,成为中亚地区珍贵的经济鱼类。为了改善我国盐碱水域的生产性能,增加养殖优质鱼类,我国于2000年从乌兹别克斯坦引进了卡拉白鱼。20年以来,科研工作者经过坚持不懈的努力和辛勤工作,卡拉白鱼的引进、繁殖和养殖获得了成功,并在盐碱地推广,取得了可喜的成效。然而,卡拉白鱼是小型经济鱼类,怀卵量较低,至今尚未形成规模化生产。

目前,国外关于卡拉白鱼的研究文献很少,仅见塔氏卡拉白鱼(Chalcalburnustarichi)的氨、尿素代谢研究及适应高盐碱生活史的报道[2—3]。国内学者已完成了卡拉白鱼养殖生物学、营养学和某些繁殖生理方面的研究[4—8]；然而,尚未见其精子活力的研究报道。鱼类精子的激活与离子和pH值有关[9]。精子的活力直接影响受精率。因此,研究盐度和碱度对卡拉白鱼精子活力及受精率的影响,对其苗种的规模化生产以及盐碱水域资源的开发和利用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 亲鱼来源

2018年4～5月的供试卡拉白鱼取自江苏省农业科学院宿迁农科所繁育基地，为3龄鱼，体长(17.87±1.21)cm,体质量(72.59±6.53)g。每个实验组供试3尾鱼,实验结果为3尾鱼的平均值。

1.2 实验方法

1.2.1 不同盐度、碱度溶液的配制 NaCl、NaHCO3溶液以去离子水为溶剂,称取分析纯氯化钠和碳酸氢钠。依次配制盐度处理组浓度系列:0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 g/L;依次配制碱度处理组浓度系列：0、10、15、25、40、50、60、70 mmol/L。

1.2.2 精液采集 选取健康、体表鳞片完整的性成熟雄鱼,进行人工催产。催产药物为宁波生物制药三厂生产的鱼类催产激素。催产药物及剂量为促黄体释放激素(LRH—A2)2 μg/kg、马来酸地欧酮(DOM)1mg/kg和绒毛膜促性腺激素(HCG)0.9 mg/kg。在雄鱼腹部注射催产剂1次；在水温23～25 ℃下于10：00～14：00取精液。采精时,先擦干受试鱼的生殖孔,轻压腹部,用1 mL注射器抽取精液,抽取的精液呈乳白色,无血、尿、粪便和粘液的污染。将精液与盐溶液按1∶200的比例稀释混合。抽取20 μL的精子混合液,滴于载玻片上,使用10×10倍的显微镜进行观察，观察结果以1个视野为准。精子活力计时从精子滴入盐液混合开始。在显微镜的视野中,依照精子运动的数量大致分为100%、70%、50%、30%、5%阶段。精子活力的等级划分参考吴景贵的标准[10](略加改进)。大约100%精子激烈运动是指精子被激活后呈漩涡状运动;70%精子快速运动是指精子呈直线运动至转入中速运动前;当视野中绝大多数精子停止活动时计算寿命(即5%精子的运动时间)。室内观察温度为24～26 ℃。

1.2.3 人工受精与受精率的测定 取精液，将其覆盖于卵上,用羽毛搅拌1 min,使精卵充分接触；再以注射器抽取鱼卵，将其拨入各实验组溶液的三角瓶中受精。将受精卵摇晃10～15 min,在卵粒不粘瓶壁后,将受精卵倒入各组培养皿,每组50～100粒卵。在受精卵发育至囊胚后期统计受精率[11]。

1.3 数据处理与分析

用SPSS 17.0软件对实验数据进行统计分析。所有数据均以平均值±标准差表示；采用单因素方差分析法进行多重比较，以检验不同处理间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 不同浓度NaCl盐度溶液中精子的活力

由表1可知,当NaCl的质量浓度范围为0～7 g/L时,卡拉白鱼大约100%精子的激烈运动时间达13.67～22.00 s,70%精子的快速运动时间达21.80～31.93 s,精子的寿命为59.10～150.3 s。

表1 卡拉白鱼精子在不同NaCl质量浓度中的活力

注:同列数据后标有不同字母者表示差异显著(P<0.05)。下同。

在NaCl质量浓度0～5 g/L的范围内,随着盐度的升高,卡拉白鱼精子的快速运动时间和寿命逐渐延长；当盐度为4 g/L时,精子的快速运动时间和寿命最长,分别为31.93和150.3 s;当NaCl质量浓度为6 g/L以上时,精子活力开始下降;当NaCl质量浓度为8 g/L时,精子的快速运动时间仅有17.60 s,寿命只有77.67 s;当NaCl质量浓度达到9 g/L时,精子只是在原地颤动,在加入去离子水后又开始运动;当NaCl质量浓度为10 g/L时,精子很快死亡,即使再放入去离子水中,精子也不能被激活。实验结果表明:卡拉白鱼精子在NaCl浓度为4～5 g/L时,70%精子的快速运动时间和寿命显著长于其他各组的(P<0.05)。在鱼类的受精过程中,只有70%快速运动精子可以穿过卵膜,具有与卵结合的能力。由此可见,卡拉白鱼精子受精的最适宜NaCl浓度为4～5 g/L。

2.2 不同浓度NaHCO3溶液中精子的活力

表2显示,卡拉白鱼精子在碱度0～70 mmol/L范围内均有活力。当实验液碱度在0～10 mmol/L范围内时,精子的快速运动时间和寿命最长,分别为22.00～22.67 s和59.56～60.67 s;当碱度为15 mmol/L以上时,精子的快速运动时间和寿命显著下降(P<0.05);当碱度为70 mmol/L时,精子的激烈运动时间只有3.33 s，快速运动时间只有8.33 s，寿命只有34.00 s，均为最低(P<0.05)。

2.3 盐度和碱度对卡拉白鱼受精率的影响

由图1可见：当NaCl浓度为3 g/L时,卡拉白鱼卵的受精率高达89.43%;当盐度大于4 g/L时,受精率出现下降;当盐度为7 g/L时,受精率仅为10.34%。

不同质量浓度的NaHCO3溶液对卡拉白鱼受精率的影响如图2所示。与碱度0 mmol/L组相比，碱度10、15 mmol/L组的卡拉白鱼受精率分别下降了7.48和8.91个百分点(P>0.05);当碱度为25 mmol/L时,受精率降至42.57%(P<0.05);当碱度为70 mmol/L时，受精率为0%。

标有不同字母的数据间差异显著(P<0.05)。下同。

3 讨论

3.1 盐度对鱼类精子活力的影响

在通常情况下,鱼类精子在精巢和精浆中是不活动的,只有当精子被排到体外并被外界溶液稀释后才能活动(即激活),精子抑制和激活与渗透压、离子、pH值有关[9]。盐度通过离子作用和渗透压调节影响CAMP—ATP—Mg2+系统的运行,进而影响精子鞭毛的活动[12—13]。在盐度相对较低的溶液中,精子内ATP的产生和消耗在一段时间内可达到平衡,因此精子能够维持较长寿命;而在高盐浓度的溶液中,ATP酶活性被抑制,从而使精子活力下降[14]。在本研究中,卡拉白鱼精子在NaCl溶液浓度为0～5 g/L时,精子活力随盐度的升高而升高,当NaCl浓度为4～5 g/L时,精子的快速运动时间和寿命最长，这与徐敏等[16]和丁辰龙等[17]对大鳞鲃精子的研究结果相同。当溶液中NaCl浓度大于8 g/L时,精子活力明显降低。当NaCl浓度超过10 g/L时,精子会全部死亡,这可能是因为溶液与精子细胞质间的渗透压相差太大,精子自身的能量全部用于调节渗透压,能量消耗殆尽而亡；也可能是由于渗透压太大,直接导致精子的细胞结构受损而死亡[15]。此外,方正鲫(CarassiusauratusGibelio)和松浦镜鲤(Cynipuscarpio)的精子在盐度3～5 g/L范围内活力最强[16]；广东鲂(Megalobramahoffmanni)的精子在盐度1～5 g/L下较理想运动[18],这些研究结果与本实验的适宜盐度范围基本相符。然而,盐度对不同科、属的淡水鱼类精子活力的影响是有区别的，例如：胭脂鱼精子的快速运动时间和寿命在盐度6 g/L下最长[15]；鲑科鱼类——虹鳟(Oncorhynchusmykiss)和鲟科鱼类——西伯利亚鲟(AcipensersinensisGray)精子的最适盐度分别为7.0 g/L和1.5 g/L[19—20]。

图2 碱度对卡拉白鱼精子受精率的影响

3.2 碱度对鱼类精子活力的影响

鱼类精子活力的激活还与pH值、K+、Ca2+、Mg2+等密切相关,多数鱼类的精浆在中性或偏碱性的溶液中活力较高,在酸性溶液中活力降低或被抑制[9]。NaHCO3通过其分解产物(HCO3-和CO2)参与这些离子的运输，从而对鱼类的精子活力产生重要影响[21]。Dreanno等[22]发现CO2能抑制大菱鲆(Scophthalmusmaximus)精子的运动,这种抑制作用是不依赖pH值的。CO2可阻止精子的线粒体氧化磷酸化作用,使ATP含量降低,使鞭毛轴丝停止运动,在雄性生殖管道,因无氧环境,精子保持静止状态;当精子被排到有氧的海水中时才被激活。Morisawa等[23，24]通过实验,发现虹鳟和大马哈鱼的精子从精巢排到输精管,精子活力的获得与精液中HCO3-的增加和pH值的升高有关。

据任自达等[25]报道,当低洼盐碱地池塘水的pH值在7.2～8.6、总碱度在14.28 mmol/L、总硬度在3.08 mmol/L、含盐量在2.05 g/L以下时,养殖鱼类(四大家鱼)生长良好；当超过此范围时,鱼类的存活率和生长速度均会受到影响。姜秋俚等[26]研究了3月龄卡拉白鱼对盐碱的耐受性,结果表明:在不同NaHCO3质量浓度的水体养殖60 d后,碱度为6.47 mmol/L和10.64 mmol/L组的鱼体重分别较对照组(1.47 mmol/L)增加了5.5%和7.5%;碱度为23.65 mmol/L对鱼的生长无影响。本实验在碱度0～10 mmol/L范围内,卡拉白鱼精子的快速运动时间和寿命最长；当碱度在15 mmol/L以上时,精子的活力显著下降,这说明精子对碱度的耐受性小于幼鱼。此外,本实验碱度对卡拉白鱼精子的活力未表现出单一的促进和抑制作用,这与徐敏等[16]对大鳞鲃精子活力的研究结果相符。这可能是因为在低碱度下,NaHCO3解离的CO2含量较低而主要表现出HCO3-对精子活力的促进作用；当碱度升高时,NaHCO3解离的CO2含量增加而主要表现出CO2对精子活力的抑制作用。

3.3 盐度和碱度对鱼类受精率的影响

盐度和碱度是盐碱水域的主要理化指标,不同鱼类的繁殖对盐度和碱度的要求各不相同[27]。多数研究表明:精子的活力与受精率有重要的关系,当精子活力强时,受精率也高[27,28]。精子在快速运动期间,受精率最强；当精子转为慢速运动时,其受精能力大大减低；原地颤抖的精子不具备受精能力[27—29]。本实验发现,适于卡拉白鱼受精的盐度范围为1～3 g/L,碱度范围为0～10 mmol/L,其适宜的盐度范围比精子活力的适宜盐度范围3～5 g/L要低，这可能是因为鱼类的卵子在胚胎发育过程中受到了盐碱度的影响。王信海等指出:在实验室条件下,卡拉白鱼在NaCl质量浓度5 g/L、碱度23.65 mmol/L以下水体中生长良好[30]。这再一次说明幼鱼对盐度和碱度的耐受性高于精子对盐碱的耐受性。因此,在内陆盐碱水域的鱼类在繁殖期回到淡水中产卵和孵化,这是鱼类生殖洄游的自然规律。