葡萄果实大小的分子研究进展

谷世超，李 明，程大伟，王 莎，李芳菲，何莎莎，谢贝阳，陈锦永

(中国农业科学院 郑州果树研究所/果树生长发育与品质控制重点开放实验室，河南 郑州 450009)

葡萄(VitisviniferaL.)是多年生落叶果树，其品种多样、色彩鲜艳、口味丰富，广受消费者喜爱。葡萄果实的大小也千差万别，造成果实大小差异的原因已有较多研究，决定因素主要有品种差异(基因遗传的差异)、内源激素的调控和环境因素的影响。研究调控葡萄果实大小的调控网络有助于解释这种差异。目前，关于葡萄果粒大小的研究多集中在探索影响果实大小的转录因子，尚没有找到非常详细的调控网络。对于这些转录因子的作用途径及联系也不清楚。果实大小还与其他很多因素有关，因此研究葡萄果实大小形成机理对生产和理论研究都具有重要意义。

1 植物内源激素对果实大小的影响

植物内源激素调控葡萄果实生长发育的研究已有较多报道。如生长素通过Aux/IAA基因家族调控细胞的分裂和增殖。在赤霉素的调控通路中，DELLA蛋白是一个关键的调控因子，调控了细胞的伸长。ABA通过影响果实内部碳水化合物的积累来促进细胞的增长。

生长素通过调节细胞分裂和细胞伸长，控制植物的生长发育。生长素信号通路主要由SAUR、GH3和Aux/IAA这3个基因家族调控。目前在植物中发现了色氨酸途径、吲哚丙酮酸途径和吲哚乙腈途径3条主要IAA合成途径。Aux/IAA与生长素响应因子ARF形成二聚体，从而抑制ARF的转录调节功能，而ARF类转录因子是生长素的顺式结合因子，调控其转录表达[1]。通过利用Affymetrix芯片在葡萄全基因组中进行比，对发现ARF、AUX/IAA家族基因在葡萄果实发育的过程中的表达量升高，说明了生长素对于果实发育的调控作用[2]。Aux/IAA蛋白在番茄果实发育中通过减小细胞体积来有效抑制果皮的增厚[3]。生长素对于葡萄果实增大的作用在葡萄研究中较少报道，但是在其他果实中的研究已经有所提及而且对生长素的主要作用因子已有研究，因此有必要解释其促进葡萄果实变大的机理。

赤霉素(gibberellin acid，GA)对于果实的作用是刺激细胞分裂和维持细胞伸长[4]。GA处理使得果实变大的机制尚不清楚，但目前在生产上已有大量运用。森田尼无核葡萄在GA处理后差异表达基因数量随时间增加而增加，主要为表达下调[5]。这些显著调控的基因与植物激素的合成、分解、代谢有关，此外外源GA3与生长素、细胞分裂素、油菜素甾体、脱落酸(ABA)、乙烯、细胞壁修饰酶等通过诱导细胞壁松弛引起浆果膨大过程。在赤霉素信号转导过程中，DELLA蛋白是GA信号转导的抑制因子，SPY和EL1能够修饰并激活DELLA蛋白，对GA信号转导具有抑制作用[6]。在葡萄的簇出期、满开期、浆果发育时期施用外源GA3后，果实内部参与蔗糖和己糖代谢、激素和次生代谢以及非生物和生物刺激的多个转录组有增加[7]。在汤普森无核葡萄中GA信号通过DELLAs (VvDELLA2和VvDELLA3)、两个GA受体(VvGID1a和VvGID1b)，以及两个GA特异性F-box蛋白(VvSLY1a和VvSLY1b)传导并发挥作用。VvDELLA蛋白和内源性生物活性气体的水平与不同器官对外源性GA的反应有关[8]。随着己糖浓度的增加，GA3增加了可溶性转化酶的活性，这表明这种酶通过改变浆果的水势参与了浆果的生长[9]。溶质的存在会增加浆果的渗透势，最终导致韧皮部的水输送增加[10]。由于GA3处理后浆果大小的增加与浆果的含水量密切相关，因此水通道蛋白可能参与了这一反应。在浆果发育过程中，水通道蛋白表达基因可能受到时间和空间上的调控[11]。干旱诱导的水通道蛋白基因MdPIP1;3在富士苹果果实膨大过程中表达增强[12]。MdPIP1;3的转基因番茄植株对干旱胁迫的耐受性增强，离体叶片失水速率比野生型慢，气孔对干旱的响应比野生型敏感。此外，转基因番茄果实的长度和直径比野生型增长更快而且果实大小和鲜重均大于野生型。

ABA通过与其他激素协同共同作用于果实成熟，其对于果实的膨大作用体现在对于果实内含物质的积累方面。在猕猴桃中ABA的含量影响果实内部碳水化合物的积累[13]。ABA通过降低乙烯的合成，刺激番茄果实生长过程中的细胞扩大，从而影响果实的大小[14]。糖的含量和成分调节着这些激素的信号。在玫瑰花瓣中碳水化合物的累积对于细胞大小具有决定性作用[15]。在水稻籽粒中ABA与蔗糖互作通过调节籽粒中灌浆关键的酶活性同时提高了蔗糖代谢的相关基因表达，提高了同化物向籽粒的转运，进而促进籽粒的增大[16]。

细胞分裂素对于果实的调控作用也有较多报道。10 mg/L的CPPU可以促进辽峰葡萄果粒膨大[17]。在‘藤稔’葡萄花后1周喷施25 mg/L GA3+5 mg/L CPPU处理较对照可以显著提高果穗重、果粒重，说明细胞分裂素物质对于葡萄果实膨大有作用[18]。关于细胞分裂素在拟南芥中的合成和转导途径已经阐述较为清晰。细胞分裂素类物质是腺嘌呤的衍生物，植物体内主要由反式玉米素型(tZ-CTK)和异戊烯基腺嘌呤型(iP-CTK)发挥作用。其中反式玉米素tZ及其核苷tZR，异戊烯基腺嘌呤iP及其腺苷iPR是主要的功能成分[19]。细胞色素P450单加氧酶CYP735A1和CYP735A2，负责将核苷酸形式的iPR转化成核苷酸形式的 tZR，说明该家族对于细胞分裂素合成有促进作用。CTK可以调控植物的生长发育，协调植物根冠关系。CPPU的使用提高了果实内源IAA和GA3的含量并且降低了内源ABA含量，促进了甜瓜果实的生长[20]。

2 果实大小相关调控因子研究进展

转录因子(TFs)作为基因表达的调控因子，在植物发育和对激素信号的响应中发挥着重要作用[21]。NAC、MADS-box、细胞色素P450(CYP)、bHLH、MYB这些转录因子家族对于果实的发育过程具有不同的作用。不同的转录因子家族通过相互作用共同完成了对于果实大小的调控，因此有必要阐明果实的具体调控路径，从而明确各通路的协调配合作用。

2.1 NAC家族对果实大小的作用

NAC蛋白域是植物特异性转录因子中最大的家族之一，每个亚家族具有特定的功能[22]。VvNAC26为NAC家族的一员，与葡萄浆果的早期发育有关，参与调控葡萄果实的大小[23]。NAC蛋白对于细胞的增殖与扩张的作用已有较多的报道。在杨树(Populustrichocarpa)中，过表达PopNAC122降低了总体株高以及细胞的大小和数量[24]。在玫瑰花瓣中NAC转录因子通过和乙烯调控microRNA164转录后的RhNAC100模块来调控细胞的体积[25]。在拟南芥中，RhNAC100通过介导乙烯从而微调microRNA164/RhNAC100模块来调控细胞的膨胀[25]。NAC转录因子内的启动子作为苜蓿次生细胞壁增厚的主开关，其通过与SND1基因结合从而达到调控细胞壁增殖的作用[26]。NAC蛋白家族对于细胞的增殖与扩张具有关键作用，又参与葡萄的早期发育，因此猜测在调控果实大小方面具有至关重要的作用。

2.2 MADS-box对果实大小的作用

通过对有核和无核葡萄的MADS-box家族中转录因子VviAGL11的表达量分析得知，其转录产物与种子木质化和最终种子大小有必然关联，促进种子的伸长和细胞数量的增加[27]。葡萄种子数量和大小与葡萄果实的大小具有一定的相关性[28]。拟南芥中的GORDITA(B-sister MADS-box protein)通过细胞膨胀对于外胚层生长具有促进作用[29]。MADS-box家族中的SlMBP21蛋白参与调控番茄的乙烯和生长素的浓度，其对于细胞扩张具有负调性，从而抑制萼片的生长[30]。果实的最终大小和形状是由器官发生决定的。器官发生是细胞生长、分化和形态建成的协调过程。MADS-box基因家族在植物的不同组织和部位都有调控细胞大小的功能，但在葡萄中的研究还较少，但是通过番茄和葡萄的转录组分析发现了类似的调控果实大小的转录因子[31]。因此，可以通过此过程来探究葡萄果实大小的调控通路。

2.3 CYP家族基因对果实大小的调控

细胞色素P450(CYP)家族是植物蛋白最大的家族之一[32]，对果实大小具有一定的作用。在甜樱桃(PrunusaviumL.)、拟南芥、小麦等作物上已有研究报道，其主要通过影响胚珠发育和种子中表皮细胞的增殖，来影响果实大小[33]，但其对葡萄果实大小的影响鲜有报道。细胞色素P450家族对于果实大小具有一定的作用。在甜樱桃果实中PaCYP78A9基因通过介导中果皮细胞的增殖和膨胀进而影响果实大小[34]。在一个水稻突变体中大颗粒的突变体编码CYP78A13通过介导细胞周期进展来调节籽粒大小[35]。小麦种皮细胞数由TaCYP78A3表达水平决定，其通过影响发育中的胚珠和种子中表皮细胞的增殖程度，进而对于种子的大小具有影响[33]。P450家族基因对于果实细胞的增殖和膨胀具有作用，而且此家族转录因子在果树中已经可以验证功能，因此有必要在葡萄中进行深度挖掘。

2.4 bHLH家族对果实大小的调控作用

bHLH蛋白是一类在植物发育过程中发挥多种作用的转录因子。在水稻基因组中已鉴定出167种bHLH蛋白[36]。bHLH包含两个功能独特的区域：basic(b)区域用于DNA结合，helix-loop-helix(HLH)区域用于蛋白二聚[37]。bHLH家族通常与植物激素的作用机理有关，通过与激素通路的结合可以更好地解析植物激素对于果实大小的调控途径。同时该转录因子家族又作用于一些新的基因，由此可以挖掘一些较新的路径。

bHLH蛋白在肉质果实的发育过程中通过调控生长素以及赤霉素对于果实大小发挥作用。bHLH家族中的VvCEB1蛋白调控生长素代谢基因和信号转导途径，从而促进了葡萄组织的变大[38]。桃子果实变大过程中生长素的形成受bZIP、NAC、TCP和SUPERMAN转录因子的调控，通过形成生长素诱导因子和bHLH转录因子从而调控桃果实细胞扩张[39]。生长素诱导因子诱导AP2/ERF表达，增强细胞周期相关蛋白活性，导致细胞增殖。NAC、TCP、SUPERMAN等转录因子对于细胞的分生具有同样的效果。因此细胞膨胀和细胞增殖协同进行，导致桃果实膨大。生长素与这些转录调控信号之间的联系目前还没有较好的解释，因此有必要进行该家族转录调控的研究。GA诱导了bHLH家族的SlPRE2基因从而调控番茄果实变大。通过缺失突变体的研究发现，在突变体中内源赤霉酸的合成减少，胎盘、种子和果皮细胞减少，同时参与调控细胞扩大的SlXTH2和SlXTH5基因的表达减少[40]。

bHLH家族基因对于细胞的增殖与扩张也具有作用。拟南芥中的SPATULA(SPT)基因调控bHLH转录因子，对幼叶基部细胞增殖活跃的区域发挥作用，抑制了叶片大小和叶片内的总细胞数。OsbHLH107是bHLH家族中与细胞周期相关的一种核转录因子，参与调控了水稻小穗壳细胞数量的增加。通过转基因试验验证了相同的亚家族中OsPIL13 (OsPIL1)、OsPIL16 (APG)和OsPIL11都可以调节籽粒大小[41]。在拟南芥中转录变异体BPEp编码一种bHLH转录因子，通过控制有丝分裂后细胞的扩张来限制花瓣的大小[42]。bHLH家族的一对拮抗蛋白通过调控籽粒表皮细胞的长度影响水稻籽粒的大小，通过构建这两个转基因体系发现过表达PGL1和沉默APG两株系得到了一致的表型。并且两者与果实中与长度相关的基因GS3和SRS3并无关联[43]，这可能是一种新的调节因子。bHLH家族转录因子对于果实大小的调控涉及到多条激素和转录因子途径，其可能是一个关键调节因子。

2.5 MYB家族对果实大小的作用

MYB家族转录因子对于NAC家族具有负反馈调节。MYB家族的作用大多数与花青素合成有关[44]，而且在杨梅的花青素合成过程中MYB和bHLH转录因子共同作用诱导花青素的合成[45]。但是近来研究发现在番茄的果实中，FSB1 MYBI复合物的形成对细胞扩张有负面影响，尤其是对那些具有最大扩张潜能的细胞，FSM1识别FSB1中与MYBI相同的区域，具有竞争作用[46]。葡萄中的R2R3-MYB转录因子(VvMYB5b)在番茄中诱导矮化、叶片结构的改变、花形态的改变、果实在绿熟期色素和光泽的改变以及种子萌发、受损等。果实和叶片的扫描电镜证实了细胞大小和形状的改变[47]。MYB的转录因子可能参与了葡萄果实调控的某个过程。

2.6 多转录因子交互作用影响果实大小

在果实大小的调控网络中，各转录因子间往往交互发生作用。MYB在果实大小的调控路径中就和其他转录因子共同发挥作用，该转录因子可能是一个关键的中间转录成分，研究其作用可能对整个调控网络的揭示是一个关键。通过对番茄和葡萄转录组一致序列和微阵列数据库的挖掘，确定了AP2-EREBP、ARF、bHLH、bZIP、C2C2-GATA、FHA、GeBP、GRAS、HB、LIM、MYB、PBF-2样、SBP、WRKY等14个类群的23个转录因子作为果实早期发育的候选调控基因[31]。这些转录因子的确定是我们构建细胞大小调控网络的基础与依据。在梨果实的发育过程中，利用两个大小不同的梨品种，采用RNA-seq高通量测序，分析果实发育早期基因转录水平的变化，共鉴定了797个差异表达基因(DEGs)。发现果实大小可能与细胞分裂素和赤霉素的早期降解有关。其中NAC、ERF、bHLH转录因子的差异表达与细胞分裂素脱氢酶、赤霉素双加氧酶基因高度相关[48]。通过对于梨果实的研究发现多种转录因子与激素合成降解途径共同调控果实大小，但具体的调控路径还不十分清晰。生长调节因子(GRF)是植物生长发育过程中的重要蛋白，在植物生长发育过程中起着重要作用[49]。从安柳甜橙中提取了9个柑橘GRF基因(CsGRF1-9)。通过PCR扩增寻找到了两个保守序列(QLQ和WRC)。经过转录组分析寻找到差异表达的基因，同时通过启动子区域分析找到两种赤霉素信号转导顺式作用原件。在CsGRF5和CsGRF6的启动子都有两种元件，但GA3处理对CsGRF5和CsGRF6的转录水平没有影响。相反，只有一种元素的CsGRF1、CsGRF2、CsGRF3、CsGRF7、CsGRF8、CsGRF9的转录水平则显著受GA处理的影响。对GA处理的反应表明，CsGRFs可能通过GA途径或GA独立途径调控叶片和果实细胞的膨大，从而促进其膨大。多转录因子共同作用于果实大小的调控在葡萄中尚未见报道，针对于这些多因子调控网络，我们可以借鉴其研究方案，在葡萄果实中类比其作用解析调控网络。

3 影响果实大小的其他因素

关于调控果实大小的转录因子还有很多，利用其研究手段可以给我们解析调控果实大小的网络提供理论支持。

AINTEGUMENTA (ANT)类转录因子是植物特有的一种转录因子，通过维持细胞在器官发生过程中的分生能力来调控花器官原基的细胞增殖和器官生长[50]。在葡萄藤基因中与花同源的基因，在该物种中具有类似的生物学作用。通过检测花器官的大小与AtANT葡萄同系物VviANT1表达水平之间的相关性，证明ANT参与了葡萄果实大小的调控。在拟南芥中，转录因子AINTEGUMENTA (ANT)可以影响细胞增殖的结束，是调节组织大小的关键基因[51]。

FW2.2基因在番茄果实中控制果实重量。FW2.2是在植物中首先被克隆出来的QTL，定位到第2号染色体的末端[52]。FW2.2等位基因使果重增加，导致果实胎座的增大和小柱区域的增加，FW2.2 对于果实增重的贡献率达到了30%[53，54]。FW2.2启动子处的突变导致该基因在果实发育过程中异时表达，从而导致栽培番茄和其野生近缘种的果实大小不同。FW2.2是一种膜锚定蛋白，参与细胞周期途径，从而控制子房的大小[55]。FW2.2 编码一种未知功能的跨膜蛋白，与CKII激酶亚基相互作用形成细胞周期调控复合体，抑制细胞分裂，参与细胞周期信号途径[56]。在玉米中的同源基因被命名为CNR，这两种基因均在果实发育过程中通过调节细胞的数量来影响器官的大小[57]。在桃基因组中鉴定出来FW2.2/CNR的家族成员，其置信区间落于控制甜樱桃大小的数量性状置信区间内，通过樱桃果实大小的分化也验证了这些基因对于果实大小的调控作用。

4 研究展望

通过比较各转录因子在葡萄和其他果实中对于果实大小的调控作用发现果实大小的调控是一个复杂而且持续的过程。目前在以下几个方面的研究还不够深入：(1)果实大小是一个数量性状，在不同的转录因子家族中证实了其对果实大小的作用，但整个调控网络尚不清楚。(2)在果实的发育过程中，激素对果实的调控与转录因子之间的调控存在着某种联系，两者的作用途径也存在一定的交集，但目前研究尚未解析清楚。(3)关于调控果实发育的其他影响因子，作用机制也不清晰。

对于后续果实大小的研究从蛋白作用开始，从转录因子靶蛋白的作用机制上找寻不同作用通路的交点，然后进行整个网络的研究。果实大小是一个数量性状，其影响因素较多，有必要进行主效影响因素的探究，寻找到主效作用因子从而合理构建调控网络。应借鉴利用目前研究较为透彻的思路与方法进行新的转录调控因素的探究，这样才能较好地整体掌握转录调控通路。