三七HPLC 指纹图谱及5 种成分测定

李 宁 高小惠∗王子幼龚云麒∗刘军锋杨兆祥崔秀明王峥涛

（1.昆药集团股份有限公司，云南 昆明650100； 2.上海中医药大学中药研究所教育部中药标准化重点实验室，上海201203； 3.云南省三七资源可持续利用重点实验室，云南 昆明650500）

三七为五加科人参属植物三七Panax notoginseng（Burk.） F.H.Chen 的干燥根和根茎［1］。三七是我国传统名贵大宗药材，具有活血散瘀、消肿定痛的功效，目前常用于预防和治疗心脑血管系统疾病。三七主产于云南，种植基地规模大，有效成分较清楚，临床疗效确切，市场前景广阔。云南省已出台三七产业“十三五” 发展规划，拟将三七培育打造成千亿级产业［2］。

中成药大品种是三七产业发展的重要推手。血塞通系列产品是以三七根茎总皂苷制成的中成药，是目前重要的心脑血管用药［3-4］。三七于1985 年最早获得血塞通注射液生产批文，并于1996 年获得注射用血塞通冻干生产批文。除注射剂外，目前该产品已发展成包括软胶囊、硬胶囊、滴丸、片剂、泡腾片、咀嚼片、分散片、颗粒剂等多种剂型的产品集群。

质量是药品疗效的根本保证，是优质中成药评价的核心。基于从原料、生产、质控、再评价到其他竞争力的全链条质量评价体系应成为优质中成药评价的核心标准。优质的质量标准体系应包括原料、中间体、辅料、包材等一系列标准［5］。就血塞通产业而言，缺乏符合血塞通特点的三七根茎药材标准是亟待解决的重要问题。根与根茎属于三七植物的不同部位。虽然三七已被《中国药典》 我国《香港中药材标准》 和《台湾中药典》 《美国草药典》 《欧洲药典》 《英国药典》 及ISO 标准等多个质量标准体系收载［4，6］，但《香港中药材标准》《台湾中药典》 《欧洲药典》 《英国药典》 仅收载根，不包含根茎。《中国药典》 《美国草药典》 中根与根茎混列。目前已有较多的研究表明三七根与根茎的质量存在较明显的差异性，化学成分及含有量均有不同［7-9］。ISO 标准中虽将根与根茎分列，但无指纹图谱测定项，含有量测定仅包含三七皂苷R1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg13 种成分。注射用血塞通冻干现行的国家标准对成品的质量进行了较严格的限定，规定指纹图谱相似度不得低于0.95，且分别对三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd 5 种成分含有量的上、下限进行了规定［10］。

本研究建立三七HPLC 指纹图谱，并同时测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd 的含有量，以期为制订符合血塞通特点的三七根茎药材标准提供基础性研究资料。

1 材料

ACQUITY Arc 高效液相色谱仪（包括紫外检测器、柱温箱、自动进样器、在线脱气机、四元梯度泵） （美国Waters 公司）；XP205、XPE26 分析电子天平（瑞士Mettler 公司）；5510E-DTH 超声提取仪（美国Branson 公司）；VD53 真空干燥箱（德国Binder 公司）；Milli-Q 超纯水机（美国Millipore 公司）。

15 批三七根茎药材，批号见表1，由昆药集团股份有限公司提供，均购自云南文山，为注射用血塞通冻干实际生产用药材，所有药材经昆药集团股份有限公司李宁博士鉴定为正品，凭证标本存放于昆药集团股份有限公司研究院天然产物部。三七总皂苷对照品（批号101176-201202） 购自中国食品药品检定研究院。乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液制备 取三七根茎药材粉末（过4 号筛） 0.3 g，精密称定至离心管中，加入70%甲醇水溶液10 mL，超声10 min，离心，转移上清液至25 mL 量瓶中，重复提取2 次，每次加入70%甲醇水溶液5 mL，合并3 次提取液，定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2 对照品溶液制备 精密称取三七总皂苷对照提取物适量，加入70%甲醇水溶液制成每1 mL 含2.5 mg 的溶液，即得。

2.3 色谱条件 Waters XBridge C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A） -水（B），梯度洗脱（0～20 min，19% A；20～45 min，19%～46% A；45～50 min，46%～100% A；50～60 min，100% A）；体积流量1.5 mL／min；检测波长203 nm；柱温25 ℃；进样量20 μL。

2.4 指纹图谱方法学考察

2.4.1 精密度试验 取同一批号样品 （批号KY170418），按 “2.1” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3” 项条件下连续进样6 次，测得各色谱图的相似度均大于0.99，三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rd 色谱峰保留时间、峰面积RSD 分别为0.04%～0.23%、0.26%～0.49%。表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取同一批号样品 （批号KY170418），按 “2.1” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3” 项条件下进样，测得各色谱图的相似度均大于0.99，三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rd 色谱峰保留时间与峰面积RSD 分别为0.03%～0.61%、0.64%～1.78%。表明该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 取同一批号样品 （批号KY170418），按 “2.1” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3” 项条件下，分别于制备后0、2、4、8、12、18、24、36、48、60 h 进样，测得各色谱图的相似度均大于0.99，三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rd色谱峰保留时间与峰面积RSD 分别为0.11%～1.95%、1.65%～2.11%。表明供试品溶液在60 h内稳定性良好。

2.5 指纹图谱建立 取不同批次三七根茎药材共15 批，按“2.1” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3” 项条件下进样，将所得的色谱图输入相似度评价软件进行相似度比较，剪切5 min 之前和45 min 之后的色谱峰，采用中位数法生成参照指纹图谱。各批次药材指纹图谱的叠加图及共有模式指纹图谱分别见图1～2。以共有模式为参照，计算各批次样品的相似度，结果见表1，所有批次样品的相似度均在0.99 以上。指纹图谱中可见5 个主要共有峰，占总峰面积90% 以上。与对照提取物色谱图对照保留时间，共有峰1～5 分别指认鉴定为三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rd。

图1 15 批样品HPLC 指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints of fifteen batches of samples

图2 15 批样品共有模式图Fig.2 Common patterns of fifteen batches of samples

表1 15 批样品相似度Tab.1 Similarities of fifteen batches of samples

2.6 含有量测定方法学考察 本研究建立的指纹图谱分析方法可同时对三七根茎药材中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd 5 种主要成分进行含有量测定。方法的精密度、重复性和稳定性试验参见“2.4” 项下部分。

2.6.1 专属性试验 取样品（批号KY170418），按“2.1” 项下方法制备供试品溶液，取三七总皂苷对照品，按“2.2” 项下方法制备对照品溶液，取70%甲醇水溶液为空白溶液，分别在“2.3” 项条件下进样。空白溶液色谱图中无干扰峰影响定量。对照品溶液与供试品溶液色谱图中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd 色谱峰与相邻峰分离良好（分离度大于1.5）。结果表明该方法专属性良好。见图3。

2.6.2 线性关系考察 精密称取三七总皂苷对照品，以70%甲醇水溶液溶解并逐级稀释成一系列不同质量浓度。在“2.3” 项条件下进样，以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，结果见表2，表明各成分在各自范围内线性关系良好。

图3 各成分HPLC 色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents

2.6.3 加样回收率试验 分别取已知含有量样品（批号KY170418） 9 份，每份约0.15 g，精密称定。分3 组各分别加入50%、100%、150%的对照品。按“2.1” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3” 项条件下进样，计算加样回收率。三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd 的平均加样回收率分别为101.78%、97.22%、102.14%、98.96%、101.73%，RSD 值分别 为 1.58%、1.31%、2.17%、1.55%、1.80%。

2.7 样品含有量测定 取15 批样品，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，取三七总皂苷对照品，按“2.2” 项下方法制备对照品溶液，分别在“2.3” 项条件下进样，计算各成分的含有量，结果见表3。

3 讨论

三七的质量评价研究为中药、天然药物的研究热点，已有相当多的文献报道，三七也被国内外众多质量标准体系收载。目前三七广泛用于中成药制剂［11-12］，我国含三七中成药品种共计455 个，总计超过2 000 个［2］。三七作为大宗常用药材，现有的药材标准在制订过程中注重标准的普适性。对于具体的中成药品种而言，并非最优的原料药材标准［13］。为保障中成药质量的优质性，应结合产品特点量身制订适合的原料药材标准。本研究对血塞通原料药材三七根茎的质量进行研究，以期形成符合血塞通特点的行业、团体和企业内控标准。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

表3 各成分含有量测定结果Tab.3 Results of content determination of various constituents

在供试品溶液制备方面，2015 年版《中国药典》 提取方法为静置过夜，《美国草药典》 为多次超声、离心。本研究对比了2 种方法的提取率，结果显示提取率相当，后者更为方便、快速。

本研究采用了中国食品药品检定研究院提供的三七总皂苷对照品。该对照品经中国食品药品检定研究院标定，已明确三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rd 的含有量。该对照品用于注射用血塞通冻干的测定已经过多年实践检验，相对于分别购买单标再配制混标更为经济、方便。

本研究对比了包括Phenomenex Kinetex C18100 Å （4.6 mm×100 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX SB-Aq （4.6 mm×250 mm，5 μm）、Waters XBridge Shield RP18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Welch Ultimate AQ-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Waters XBridge C18（4.6 mm×250 mm，5 μm） 等在内的多种色谱柱，以Waters XBridge C18（4.6 mm×250 mm，5 μm） 效果最优。三七根茎化学成分的分离效果对色谱填料非常敏感，为确保结果的重现性和可比性，课题组建议在质量标准中规定色谱柱型号。

本研究对色谱梯度洗脱程序进行了大量的摸索与优化。前20 min 采用等度洗脱，流动相A 的比例对人参皂苷Rg1与人参皂苷Re 的分离非常重要。为重现本方法，课题组建议实验人员根据自身实验条件，以19%A 为中心，以±1%为单位进行逐步调整，以确保人参皂苷Rg1与人参皂苷Re 达到基线分离。另外，45 min 时A 的比例对人参皂苷Rb1及其附近色谱峰的分离尤为关键，0.5%的变化即可对分离效果造成较大影响。故建议以46%A 为中心，以±0.5%为单位进行逐步调整，以寻求最佳的分离梯度。应当指出的是，三七中已分离鉴定的化合物数量超过200 个［14］，即使精制后的三七总皂苷的化学成分也非常复杂［15-16］，色谱图中人参皂苷Rb1附近的色谱峰尤为丰富。尽管实验对分离条件进行了细致的优化，以目前常规一维HPLC 的分离能力，微量的共流出是难以避免的。有研究采用二维色谱［17］或液质联用技术［18］进行了探索，以降低共流出和基质效应对定量的干扰，使测定结果更加接近真实值。但特定且昂贵的仪器和对操作者要求制约了这些方法在工业界的推广应用。

根据本研究结果，将企业内控标准暂定为药材指纹图谱相似度不得低于0.98。该方法指认了占总峰面积90%以上的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd 5 个主要共有峰，目前尚未对其他峰面积较小的色谱峰进行指认。在未来的工作中，课题组将以本研究建立的方法为工具，进一步系统研究各成分在药材、中间体、制剂间的转移传递规律。

该方法在获得指纹图谱的同时可对三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd 5 种成分进行含有量测定。15 批药材5 种成分含有量得总和均高于13.0%。其中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb13 种成分总和均高于11.0%，远高于2015 年版《中国药典》规定的5%，也高于ISO 标准规定的8%。根据本研究结果，将企业内控标准暂定为药材5 种成分含有量不得低于10%。在后续研究中，课题组将进一步积累药材含有量数据，以期为血塞通用三七根茎设定更为合理的含有量下限。