HPLC 法同时测定华佗救心丸中8 种蟾蜍二烯内酯

周文莉，祝宇龙，李龙飞，赵 冰，彭 灿∗，阚家义

（1.安徽中医药大学药学院，中药复方安徽省重点实验室，安徽 合肥230012； 2.华佗国药股份有限公司，安徽 亳州236800； 3.安徽省食品药品检验研究院，安徽 合肥230051）

蟾酥是蟾蜍科动物中华大蟾蜍或黑框蟾蜍耳后腺及表皮腺体的分泌物，白色乳状液体或浅黄色浆液［1］，是我国常用的一味传统名贵中药，主要含有蟾蜍二烯羟酸内酯类［2-3］、蟾毒色胺类、甾醇类等成分，以蟾酥二烯内酯类为主。现代药理学研究表明［4-7］，蟾酥有增强心肌收缩力、麻醉、降压、抗炎、抗肿瘤、抗辐射、抑制血小板聚集、增加冠状动脉血流等药理活性，但其毒性也大，用药不当会出现严重不良反应［8-10］，故对其服用剂量有严格要求。

华佗救心丸由蟾酥、人参茎叶总皂苷、牛胆膏粉、人工麝香、珍珠、人工牛黄、冰片、三七膏粉组成［11-13］，其执行标准收载于《卫生部药品标准.中药成方制剂》 第十九册（标准文号WS3-B-3675-98），但目前大多以单一或几种成分含有量为指标来表征其质量［14-16］，存在操作繁琐、时间长、检测不全面、成本高等缺点，故有必要研究开发一种简便快捷、全面准确的含量测定方法。因此，本实验建立HPLC 法同时测定华佗救心丸中华蟾酥毒基、酯蟾毒配基、日蟾毒它灵、蟾毒灵、沙蟾毒精、蟾毒它灵、远华蟾毒精、华蟾毒它灵的含有量，以期对该制剂质量进行有效控制。

1 材料

1.1 仪器 Waters 2489 高效液相系统 （美国Waters 公司）；YL-060S 超声波清洗器（深圳市语路清洗设备有限公司，360 W，40 kHz）；电子天平［赛多利斯科学仪器（北京） 有限公司］；离心机（常州市万丰仪器制造有限公司）。

1.2 试剂与药物 酯蟾毒配基、华蟾酥毒基、日蟾毒它灵、蟾毒灵、沙蟾毒精、蟾毒它灵、远华蟾毒精、华蟾毒它灵对照品（纯度≥98%），均购于成都克洛玛生物科技有限公司。华佗救心丸（批号201901、201902、201903、201904、201905），由华佗国药股份有限公司提供。乙腈购于西格玛奥德里奇（上海） 贸易有限公司；甲醇购于北京百灵威科技有限公司；乙醇购于上海润捷化学试剂有限公司；水为超纯水 （美国Pall 公司纯水机制备）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Thermo Scientific C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相水（A） -乙腈（B），梯度洗脱 （0～2 min，20%～38% B；2～5 min，38%～56% B；5～19 min，56%～66% B；19～19.1 min，66%～20% B；19.1～20 min，20%B）；体积流量0.6 mL／min；检测波长296 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取远华蟾毒精、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基、日蟾毒它灵、蟾毒灵、沙蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵对照品适量，甲醇制成1 mg／mL 贮备液，吸取适量，甲醇稀释，即得（0.1 mg／mL）。

2.2.2 供试品溶液 取5 批丸剂，研细，每批取约0.3 g，精密称定，精密加入20 mL 甲醇，室温下超声处理20 min 后取出，冷却，甲醇补足减失的质量，振荡摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 精密量取“2.2” 项下对照品、供试品溶液各10 μL，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分色谱峰与其前后峰的分离度均大于1.5，理论塔板数以蟾毒灵峰计为3 000，其他成分对测定无干扰。

2.3.2 线性关系考察 精密吸取“2.2.1” 项下贮备液适量于量瓶中，甲醇稀释至刻度，振荡摇匀，制成质量浓度为5、10、25、50、100 μg／mL的系列溶液，精密吸取适量，在“2.1” 项色谱条件下进样测定。以峰面积为纵坐标（Y），溶液质量浓度为横坐标（X） 进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度试验 精密吸取“2.2.1” 项下对照品溶液10 μL，在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得日蟾毒他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒他灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基峰面积RSD 分别为0.41%、0.43%、0.42%、0.43%、0.41%、0.44%、0.52%、0.51%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 取同一供试品溶液（批号201901） 适 量，于2、4、6、12、24、48 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得日蟾毒他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒他灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基峰面积RSD 分别为0.54%、0.52%、0.45%、0.58%、0.46%、0.60%、0.65%、0.61%，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constitutents

2.3.5 重复性试验 取丸剂（批号201901） 适量，按“2.2.2” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得日蟾毒他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒他灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基峰面积RSD 分别为 2.35%、3.47%、3.59%、2.84%、1.46%、1.67%、0.27%、0.49%，表明该方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验 取丸剂（批号201901） 适量，共6 份，加入“2.2.1” 项下贮备液适量，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，日蟾毒他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒他灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基平均加样回收率分别 为 98.54%、95.07%、97.45%、99.58%、100.46%、102.59%、98.65%、97.61%，RSD 分别为2.75%、2.46%、1.53%、2.81%、1.42%、1.60%、2.03%、2.19%。

2.3.7 样品含有量测定 取5 批丸剂，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算含有量，结果见表2。

3 讨论

3.1 提取溶剂、提取时间筛选 本实验考察了不同提取溶剂（甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇）、提取时间（10、20、40、60 min） 对提取效果的影响，发现以甲醇为提取溶剂超声提取20 min 时，蟾蜍二烯内酯类成分提取效率最高。

表2 各成分含有量测定结果（mg／g， n＝3）Tab.2 Results of content determination of various constituents （mg／g， n＝3）

3.2 色谱条件筛选 本实验考察了Unitary C18、Thermo Scientific C18色谱柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm） 的分离效果，发现后者更理想。然后，考察了不同柱温（25、30、35、40 ℃），发现30 ℃时分离效果最佳。

3.3 流动相筛选 本实验考察了0.15% 磷酸-乙腈、0.5% 甲酸-乙腈、水-乙腈的分离效果，发现以水-乙腈为流动相时色谱峰峰形较好，并且为非酸性溶液，对仪器损害较小，并按“2.1” 项下比例梯度洗脱，此时各成分色谱峰分离度均大于1.5，而且峰形完整。

4 结论

本实验所采用的HPLC 法具有简便、快速、稳定、精密度和重复性良好的优点，能在同一色谱条件下同时测定华佗救心丸中华蟾酥毒基、酯蟾毒配基、日蟾毒它灵、蟾毒灵、沙蟾毒精、蟾毒它灵、远华蟾毒精、华蟾毒它灵的含有量，不仅能有效鉴别该制剂中蟾酥微量成分的有无，也可对其含有量进行全面准确的检测，以期为相关质量控制提供重要保障［17-19］。