不同种植模式的霍山石斛对小鼠急性肝损伤的保护作用

李志强周红秋欧阳 臻戴 军 魏 渊韩邦兴∗

（1.江苏大学药学院，江苏 镇江212013； 2.安徽省中药资源保护与持续利用工程实验室，安徽 六安237012； 3.皖西学院 生物与制药工程学院，安徽 六安237012）

霍山石斛Dendrobium huoshanenseC.Z.Tang et S.J.Cheng 为兰科石斛属多年生草本植物，在我国有着悠久的药用历史。霍山石斛性微寒，味甘、淡，在《本草纲目拾遗》 中有“清胃除虚热，生津已劳损” 的记载［1］。现代药理研究［2-4］发现霍山石斛具有保肝、抗氧化、抗衰老、调节免疫、抗肿瘤和抗白内障等功效。因其广泛的药理活性，霍山石斛享有“中华仙草之最” 的美誉［5］。

野生霍山石斛多与苔藓等附生在一起，生长在半阴性、湿润的峭壁和石缝间，依靠须根从空气中吸收水分，湿度对其光合作用影响较大，强光不利于其生长［6］。霍山石斛分布区域窄、自然繁殖率低，对生长环境要求十分苛刻，加之人们过度采挖，野生霍山石斛资源濒临灭绝［7］。霍山石斛种子在自然环境下萌发率极低，而组织培养快速繁殖技术可以通过类原球茎等途径获取成活率高的霍山石斛种苗［8］。霍山石斛种苗的培育模式主要为仿野生种植、林下石子种植以及设施种植模式。仿野生种植模式完全模拟野生霍山石斛的生长环境，选取具有适宜温湿度及光照等条件的山崖，将种苗栽植于山崖石缝中使其自然生长。林下石子种植模式则选择山坡中通风较好、疏密适中的阔叶林、针叶林或针阔混交林，根据山体地形整理成梯田形状，采用石子和苔藓等作为基质［9］。设施种植是在大棚中控制温度湿度、通风和光照，以松树皮等作为基质进行种植［10］。霍山石斛的仿野生和林下石子种植都采用了生态种植模式，即通过模拟野生霍山石斛的自然生长环境，以期霍山石斛品质和疗效接近或达到野生霍山石斛水平。生态种植注重生态系统的整体性，提高栽培药材质量，促进中药资源的可持续发展［11］。不同种植模式的药材所受光照、温度等环境条件不同，影响了次生代谢产物的积累量，导致其临床疗效产生差异［12］。随着霍山石斛市场需求量的增加，人们对霍山石斛品质的要求不断提高，而不同模式种植的霍山石斛是否存在药效差异，何种种植模式下的霍山石斛具有最佳药效以及产生差异的相关物质基础，目前尚未见报道，生态种植模式的霍山石斛药效是否优于设施种植仍待验证。课题组前期研究［13］发现，霍山石斛对四氯化碳致小鼠急性肝损伤具有显著的保护作用。本研究使用小鼠不同急性肝损伤模型评价生态种植模式的仿野生种植、林下石子种植和设施种植模式的霍山石斛对肝损伤的保护作用，为优质霍山石斛生态种植模式规范化及其推广提供理论依据，以期为霍山石斛临床应用及资源可持续发展奠定基础。

1 材料

1.1 动物 SPF 级C57BL／6 小鼠，雄性，8 周龄，体质量（20±2） g，购自江苏大学实验动物中心，动物生产许可证号SCXK （苏） 2018-0053，实验室适应性饲养1 周后用于正式实验，维持12 h 明暗交替照明，自由饮水、进食。

1.2 药物 仿野生种植、林下石子种植和设施种植霍山石斛Dendrobium huoshanenseC.Z.Tang et S.J.Cheng 鲜品均由皖西学院韩邦兴教授提供和鉴定。石斛榨汁液的制备参考课题组前期文献［12］，将新鲜的石斛去根洗净，剪段，称取10 g，置于榨汁机中，加入100 mL 蒸馏水榨汁，用200 目滤布过滤，于-80 ℃冰箱保存备用。

1.3 试剂 对乙酰 氨基酚 （APAP，批 号FD170246）、环磷酰胺（CTX，批号DA110067） 购自萨恩化学技术 （上海） 有限公司；四氯化碳（CCl4，批号20170803） 购自国药集团化学试剂有限公司；谷丙转氨酶（ALT，批号20180610）、谷草转氨酶 （AST，批 号 20180607）、丙二醛（MDA，批号20180608）、超氧化物歧化酶（SOD，批号20180607） 试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.4 仪器 Spectra Max 190 型酶标仪（美国MD公司）；SK-Ⅰ快速混匀器 （江苏中大仪器厂）；IKA T10 basic-S25 组织匀浆器（德国IKA 公司）；Pic017 台式离心机 （美国Thermo Fisher 公司）；Model 754 型紫外分光光度计（上海现科仪器有限公司）；TE601-L 电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

2 方法

2.1 造模、分组与给药

2.1.1 CCl4肝损伤模型 将C57BL／6 小鼠随机分为8 组，每组10 只，分别为空白对照组、模型组、霍山石斛仿野生种植低剂量组［生药1.25 g／kg，参照《中国药典》 石斛用量］、霍山石斛仿野生种植高剂量组（生药7.5 g／kg）、霍山石斛林下石子种植低剂量组（生药1.25 g／kg）、霍山石斛林下石子种植高剂量组（生药7.5 g／kg）、霍山石斛设施种植低剂量组（生药1.25 g／kg） 和霍山石斛设施种植高剂量组（生药7.5 g／kg）。各给药组连续灌胃给药14 d，1 次／d，正常组和模型组同时给予等量的生理盐水，末次给药2 h 后，模型组和霍山石斛给药组腹腔注射0.5% CCl4橄榄油溶液（10 mL／kg） 进行肝损伤造模［13］，空白对照组注射等量的橄榄油，禁食不禁水，12 h 后眼底静脉窦采血，并取出肝脏。

2.1.2 APAP 肝损伤模型 分组同“2.1.1” 项下分组，各给药组连续灌胃给药14 d，1 次／d，末次给药2 h 后，模型组和各给药组腹腔注射APAP（500 mg／kg） 进行肝损伤造模［14］，空白对照组注射等量生理盐水，禁食不禁水，12 h 后眼底静脉窦采血，并取出肝脏。

2.1.3 CTX 肝损伤模型 分组同“2.1.1” 项下分组，各给药组连续灌胃给药14 d，1 次／d，空白对照组注射等量生理盐水，第6 天开始，模型组和各给药组每天腹腔注射CTX （80 mg／kg） 进行肝损伤造模［15］。末次给药后，禁食不禁水，12 h 后眼底静脉窦采血，并取出肝脏。

2.2 血清指标及肝组织中相关酶的测定 小鼠血样于37 ℃静置30 min，3 800 r／min 离心10 min，取血清，按照试剂盒的说明分别测定小鼠血清中ALT 和AST 水平。称取肝脏相同部位的肝组织制成10%肝匀浆，3 800 r／min 离心10 min，取上清，按试剂盒说明检测SOD 及MDA 水平。

2.3 肝脏病理组织切片观察 取小鼠肝脏相同部位组织，置于10% 甲醛中浸泡固定，常规石蜡包埋，切片，HE 染色，光学显微镜下观察肝脏组织病理学变化。

2.4 统计学分析 采用GraphPad Prism 6.0 软件进行统计分析，数据以（） 表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P≤0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 CCl4肝损伤模型

3.1.1 不同种植模式霍山石斛对CCl4肝损伤小鼠血清中ALT、AST 水平和肝组织匀浆中SOD、MDA水平的影响 与空白对照组比较，模型组小鼠血清ALT、AST 水平升高（P＜0.01）；肝组织中SOD 水平降低，MDA 水平升高（P＜0.01）。与模型组比较，仿野生种植高剂量组和林下石子种植高剂量组ALT、AST 水平降低（P＜0.05），其中ALT 分别降低了46.10%、53.59%，AST 分别降低了24.90%、29.47%；而设施种植高剂量组ALT 和AST 分别降低了 12.30%、11.85%，差异无 统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较，各给药组均能提高SOD 水平（P＜0.01），抑制MDA 水平（P＜0.05，P＜0.01）。见图1。

3.1.2 不同种植模式霍山石斛对CCl4肝损伤小鼠肝脏病理变化的影响 空白对照组小鼠肝细胞排列正常呈条索状，以小叶中央静脉为中心向四周呈放射状排列，无炎细胞浸润；模型组小鼠肝小叶结构紊乱，肝细胞核固缩浓染，肝细胞炎症浸润；各种植模式霍山石斛给药组肝组织与模型组相比病理变化减轻，肝小叶内肝板排列较整齐，见图2。

3.2 APAP 肝损伤模型

图1 不同种植模式霍山石斛对CCl4 致肝损伤小鼠血清中ALT、AST 和肝组织匀浆中SOD、MDA 水平的影响（n＝10）Fig.1 Effects of differently cultivated DH on the serum ALT and AST levels，and hepatic SOD，MDA of mice with CCl4-induced liver injury （n＝10）

图2 CCl4 致肝损伤小鼠肝脏病理学变化（×200）Fig.2 Hepatic pathological changes of mice with CCl4-induced liver injury （×200）

3.2.1 不同种植模式霍山石斛对APAP 肝损伤小鼠血清中ALT、AST 水平和肝组织匀浆中SOD、MDA 水平的影响 与正常对照组比较，模型组小鼠血清中ALT、AST 水平升高，肝组织中SOD 水平降低，MDA 水平升高（P＜0.01）。与模型组比较，仿野生种植低高剂量组和林下石子种植低高剂量组ALT 分别降低了18.55%、37.00%、26.66%、29.54% （P＜0.05，P＜0.01），AST 分别降低了36.83%、43.82%、41.19%、32.61% （P＜0.01）；设施种植高剂量组AST 水平降低了33.63%（P＜0.01）。与模型组比较，林下石子种植低、高剂量组SOD 水平分别升高了21.23%、21.20%（P＜0.05），设施种植高剂量组SOD 水平升高了20.50% （P＜0.01）。与模型组比较，林下石子种植低高剂量组MDA 水平分别下降了62.22%、46.25% （P＜0.01），设施种植低高剂量组MDA 分别降低了1.51% （P＞0.05）、62.22% （P＜0.01）。见图3。

图3 不同种植模式霍山石斛对APAP 致肝损伤小鼠血清中ALT、AST 和肝组织匀浆中SOD、MDA 水平的影响（n＝10）Fig.3 Effects of differenly cultivated DH on serum ALT and AST levels and hepatic SOD，MDA in mice with APAP-induced liver injury （n＝10）

3.2.2 不同种植模式霍山石斛对APAP 肝损伤小鼠肝脏病理变化的影响 空白对照组小鼠肝小叶结构未发生病理改变，细胞核明显，无炎细胞浸润；模型组小鼠肝小叶有点状坏死，肝细胞肿胀，炎性细胞浸润；不同种植模式霍山石斛给药组肝组织与模型组相比有改善，肝细胞肿胀，但肝细胞排列较正常，炎性细胞浸润减少，见图4。

3.3 CTX 肝损伤模型

3.3.1 不同种植模式霍山石斛对CTX 肝损伤小鼠血清中ALT、AST 水平和肝组织匀浆中SOD、MDA水平的影 与正常对照组比较，模型组小鼠血清中ALT、AST 水平升高（P＜0.01），肝组织中SOD 水平降低（P＜0.01），MDA 水平升高（P＜0.01）。与模型组比较，仿野生种植高剂量组和林下石子种植高剂量组ALT 分别降低了23.79%、9.07%，AST 分别降低了34.43%、25.35%，差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），设施种植高剂量组ALT 和AST 分别降低了7.44% （P＜0.05）、8.69%（P＞0.05）。与模型组比较，生态种植模式的仿野生低高剂量组和林下石子种植低、高剂量组SOD水平升高了18.33%、12.81%、13.04%、11.75%，差异具有统计学意义（P＜0.01）。与模型组比较，仿野生种植高剂量组MDA 水平下降了38.61%（P＜0.01）。见图5。

3.3.2 不同种植模式霍山石斛对CTX 肝损伤小鼠肝脏病理变化的影响 空白对照组小鼠肝组织结构正常，肝小叶清晰可辨，肝细胞排列整齐，细胞核体积较大位于细胞中央；模型组小鼠肝组织出现明显的病理变化，肝细胞排列紊乱，炎性浸润严重；与模型组比较，不同种植模式霍山石斛给药组小鼠肝细胞肿胀和胞质疏松程度减轻，小叶结构较清晰，细胞排列较整齐，点状坏死减少。见图6。

图4 APAP 致肝损伤小鼠肝脏病理学变化（×200）Fig.4 Hepatic pathological changes of mice with APAP-induced liver injury （×200）

图5 不同种植模式霍山石斛对CTX 致肝损伤小鼠血清中ALT、AST 和肝组织匀浆中SOD、MDA 水平的影响（n＝10）Fig.5 Effects of differently cultivated DH on serum ALT and AST levels，and hepatic SOD，MDA in mice with CTX-induced liver injury （n＝10）

4 讨论

图6 CTX 致肝损伤小鼠肝脏病理学变化（×200）Fig.6 Hepatic pathological changes of mice with CTX-induced liver injury （×200）

随着大健康产业的快速发展，霍山石斛因其广泛的药理活性，市场需求量剧增。目前霍山石斛存在着多种种植模式，不同种植模式对药材品质的影响一直是医药科研工作者关注的重点。甘金佳等［16］研究了不同栽培方式金线莲的品质，由于栽培基质的松密度透气性和微生物含有量的不同，使得金线莲根数和根长度差异较大，且林下栽培方式更有利于有效成分黄酮和多糖含有量的积累。周鹏等［17］研究了不同种植方式黄芪4 种黄酮类成分和总黄酮的含有量，发现野生品种黄芪中毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷和总黄酮的含有量高于栽培品种。中药生态种植根据药用植物生理和生态特性，在遵循自然规律的基础上优化种植环境，改善药用植物的生理状况，可使药材品质和疗效达到最佳［18］。霍山石斛的主要种植模式有采用生态种植的仿野生种植模式和林下石子种植模式，以及在大棚中种植的设施种植模式，关于这几种种植模式的霍山石斛的药效差异至今尚未有比较，本研究采用体内动物实验的方法，首次比较了不同种植模式的霍山石斛对小鼠肝损伤保护的作用。

课题组前期研究发现对肝损伤的保护作用是霍山石斛多种药理活性之一［13］，而肝损伤药效研究具有较好的量化指标，如肝酶学的改变、物质合成及生物降解功能的变化等［19］。Hu 等［20］研究人参皂苷Rk1 对APAP 致小鼠肝损伤的保护作用，发现人参皂苷Rk1 给药组ALT、AST、MDA 水平显著降低，同时肝脏抗氧化剂SOD 和GSH 水平均升高，表明人参皂苷Rk1 对APAP 诱导的肝毒性具有保护作用。陈春等［21］研究酢浆草对CCl4致急性肝损伤大鼠的保护作用，通过检测大鼠血清中ALT、AST、T-SOD、MDA 等发现酢浆草对CCl4致急性肝损伤大鼠具有保护作用。本实验采用多种肝损伤模型小鼠进行了多种肝损伤量化指标的测定，结果均显示生态种植的霍山石斛保肝药效优于设施种植。

在不同种植模式霍山石斛对CCl4致肝损伤的保护作用研究中，模型组与空白对照组比较，ALT、AST 和MDA 水平显著升高，SOD 水平显著下降，并且肝细胞结构严重破坏，肝细胞坏死和变性，说明模型复制成功，各给药组均能不同程度改善血清指标，同时减轻肝细胞变性和坏死程度，说明不同种植模式霍山石斛均对CCl4致肝损伤有一定保护作用。但是生态种植模式霍山石斛降低ALT和AST 水平的效果优于设施种植模式，综合评价不同模式霍山石斛降低ALT、AST、MDA 水平，升高SOD 水平的效果，生态种植模式的霍山石斛对CCl4致肝损伤的保护作用最佳。本研究使用了药物性肝损伤CTX 模型以进一步研究不同种植模式霍山石斛对肝损伤的保护作用。在此模型中，生态模式的仿野生和林下石子种植组SOD 升高，设施种植组升高SOD 无显著性差异。综合评价其他生化指标，生态模式种植的霍山石斛保肝效果最佳。在APAP 肝损伤模型中，仿野生种植和林下石子种植霍山石斛保肝效果显著，设施种植霍山石斛效果也较好。综合各组霍山石斛保肝效果，生态种植模式霍山石斛效果最佳。

生态种植与设施种植的霍山石斛对不同肝损伤小鼠的保护效果的差异，不仅与不同肝损伤机制有关，而且与不同环境下霍山石斛的次生代谢产物积累量有关。霍山石斛所含化学成分包括多糖、生物碱、黄酮、酚类、氨基酸和微量元素等［22］。其中，霍山石斛多糖能保护小鼠亚急性酒精性肝损伤，其保肝活性与清除自由基，抑制脂质过氧化，下调肝组织CYP2E1、TNF-α 和IL-1β 表达相关［23］。石斛类药材所含生物碱主要为石斛碱，金钗石斛中的生物碱对CCl4所致急性肝损伤有显著改善作用，与其抑制炎症反应有关［24］。石斛酚在抗白内障、抑制醛糖还原酶，柚皮素在抗氧化、抗炎等方面具有活性［25-27］。尽管霍山石斛不同种植模式产生的药效差异物质基础尚不明确，本研究证实了生态种植霍山石斛保肝药效的更优品质。

综上所述，本实验研究的生态种植模式与设施种植模式霍山石斛对小鼠肝损伤的保护作用存在差异，生态种植模式的霍山石斛保肝效果优于设施种植。造成药效差异的原因可能与不同种植模式的栽培基质、环境等相关，从而引起霍山石斛的性状、有效成分种类及含有量的差异，相关物质基础及具体作用机制仍待进一步研究。