白藜芦醇对马凡氏综合征动脉瘤凋亡作用机制的影响

蔡玉华，李云鹏

马凡氏综合征(Marfan syndrome， MFS)是一种常染色体显性遗传疾病，主要由原纤维蛋白-1基因(fibrillin-1 gene，FBN1)的不同突变引起结缔组织结构和功能的改变，常累及主动脉形成马凡动脉瘤而致死[1]。MFS动脉瘤的病理机制与血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的存活和死亡密切相关。研究表明可通过促进VSMCs的凋亡反应进而改善动脉瘤的过度增殖，最终减缓MFS动脉瘤病程的发生发展[2-3]。在临床治疗中，目前仍未研发出有效治疗MFS动脉瘤形成的药物，大多数MFS病人最终采用手术治疗动脉瘤，但是治疗效果一般[4]。因此，探讨MFS动脉瘤的病理机制及药物靶点治疗研究具有重要的临床意义。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 马凡氏模型小鼠(FBN1C1039G/+)购自美国赛业生物科技有限公司，DMEM培养基、胰蛋白酶购自Hyclone公司，胎牛血清购自德国PAN公司，增殖活性检测MTT试剂盒、BCA蛋白定量检测试剂盒购自上海碧云天公司，兔抗鼠Bax、Bcl-2以及β-actin抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.2 细胞培养 钝性分离C57野生小鼠和马凡模型小鼠的胸主动脉，提取野生小鼠和马凡小鼠的原代VSMCs，将各组VSMCs置于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃细胞孵育箱中，2～3 d以后换液，待细胞生长至培养皿的80%以上，采用胰蛋白酶消化传代至新的培养皿中，将4～8代的VSMCs用于实验检测。

1.3 细胞分组 各组细胞生长至培养皿的80%以上，采用无血清饥饿各组细胞24 h后，根据是否采用白藜芦醇处理，将本细胞实验分为4组：Control组，采用含有10%胎牛血清的DMEM处理野生小鼠的原代VSMCs；Control+Resveratrol组，采用含有10%的胎牛血清的DMEM培养基+10 μm白藜芦醇处理野生小鼠的原代VSMCs；MFS组，采用含有10%胎牛血清的DMEM培养基处理FBN1C1039G/+小鼠的原代VSMCs；MFS+Resveratrol组，采用含有10%的胎牛血清的DMEM培养基+10 μm白藜芦醇处理FBN1 C1039G/+小鼠的原代VSMCs。将处理后的细胞培养24h后，收集各组细胞，以备后续实验检测相关指标。

1.4 MTT检测细胞增殖率 将4组细胞以密度为1×104个/孔接种于96孔中，待细胞生长至80%以上，根据实验设计处理各组细胞24 h后，每孔再加入MTT溶液10 μL，将各组细胞置于37 ℃的细胞培养箱孵育3 h后，取出各组细胞，弃培养液，加入DMSO液体孵育10 min，最后在酶标仪检测各孔吸光度，换算各组细胞增殖率。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡率 将4组细胞根据实验设计分别处理24 h，处理步骤同前。将处理后的细胞采用胰蛋白酶消化悬浮各组VSMC后，将各组细胞依次进行以下步骤：加预冷的PBS液体洗涤、离心、加入RNA酶室温孵育30 min，加入5 μL的PI溶液，移入至流式细胞检测管内，最后将各组细胞置于流式细胞仪下检测，采用Flow Jo软件分析各组细胞凋亡水平。

1.6 Western blot检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达 将4组细胞根据实验设计分别处理24 h，处理步骤同前。将处理后的细胞加入蛋白裂解液后提取总蛋白，根据BCA试剂盒说明书检测各组细胞蛋白浓度后，再加入蛋白裂解液将各组细胞蛋白浓度调至相同。将各组蛋白依次进行电泳分离、转膜、5%牛奶封闭2 h，最后将各组蛋白条带与Bax、Bcl-2和β-actin的一抗置于4 ℃冰箱孵育过夜。次日将各组条带洗涤后，再加入相应的二抗置于室温下孵育2 h，最后于暗室加入ECL试剂盒显影和记录分析结果。

2 结 果

2.1 白藜芦醇抑制马凡动脉瘤的增殖率情况 采用MTT试剂盒检测各组VSMCs的增殖水平，结果表明MFS组的VMSCs增殖率明显高于Control组(P<0.05)，提示MFS小鼠的体外血管平滑肌细胞过度增殖模型建立成功。而与Control组相比，Control+Resveratrol组的VSMCs增殖率比较差异无统计学意义(P>0.05)，提示白藜芦醇对野生小鼠的VSMCs增殖水平无明显改变。与MFS组相比，MFS+Resveratrol组的VSMCs增殖率明显下降(P<0.05)，提示白藜芦醇可明显抑制MFS的VSMCs过度增殖反应。同时白藜芦醇对普通小鼠和MFS小鼠的VSMCs增殖率差异表现，也进一步提示白藜芦醇对MFS动脉瘤的病理机制具有一定的调控功能。详见图1。

与Control组比较，*P<0.05；

2.2 白藜芦醇促进马凡动脉瘤的凋亡率情况 采用流式细胞术检测各组VSMCs的凋亡情况，结果表明MFS组的VMSCs凋亡率明显低于Control组(P<0.05)，提示MFS小鼠的VSMCs凋亡水平下降进而促进动脉瘤的形成。而与MFS组相比，MFS+Resveratrol组的VSMCs凋亡率明显上升(P<0.05)，提示白藜芦醇可促进VSMCs的凋亡反应进而减缓动脉瘤形成。详见表1。通过检测各组增殖与凋亡水平发现，白藜芦醇对MFS小鼠的VSMCs具有促凋亡和抗增殖的作用功能，具体机制仍需进一步探索。

表1 各组VSMCs的凋亡率比较(±s)

2.3 白藜芦醇调节凋亡蛋白Bax和Bcl-2的表达情况 采用Western blot检测细胞凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达，结果表明，与Control组比较，MFS组的Bax的蛋白表达明显下降(P<0.05)，Bcl-2的蛋白表达改变无统计学意义(P>0.05)，而Bax/Bcl-2也明显下降(P<0.05)。与MFS组比较，MFS+Resveratrol组的Bax的蛋白表达上升(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达改变无统计学意义(P>0.05)，而Bax/Bcl-2也明显上升(P<0.05)。提示MFS小鼠的VSMCs的促凋亡蛋白Bax表达明显下降进而有助于MFS动脉瘤的形成，而白藜芦醇则可明显上调MFS的VSMCs的促凋亡蛋白Bax的表达进而促进凋亡反应，最终改善MFS动脉瘤的形成。详见图2。

与Control组比较，*P<0.05；与MFS组比较，#P<0.05。

3 讨 论

白藜芦醇作为天然的多酚化合物具有多重生物学效应，主要包括抗氧化、抗炎症以及调节血脂代谢，可对机体内多个系统疾病发挥重要的药理学意义[5-7]。而在心血管系统疾病研究中，白藜芦醇被证实可改善心肌缺血、动脉粥样硬化和抗心律失常等保护心血管功能的作用[8-10]。但关于白藜芦醇对马凡综合征动脉瘤作用机制的研究较少，有研究证实白藜芦醇可明显抑制VSMCs的增殖、炎症及氧化应激等病理过程进而改善血管损伤的发生发展[11-12]。在血管损伤中，VSMCs的凋亡与增殖常为对立关系，凋亡增强可限制增殖过度，抑制增殖过度则可促进凋亡的发生[13-14]。而MFS动脉瘤的形成也与VSMCs增殖过度和凋亡下降明显相关[2]。基于MFS动脉瘤与VSMCs的存活与死亡密切相关，本研究通过体外培养原代VSMCs，采用白藜芦醇处理细胞，发现白藜芦醇可明显抑制马凡小鼠VSMCs的过度增殖进而改善MFS动脉瘤的形成。分析VSMCs增殖与凋亡的对立关系，进一步验证白藜芦醇对马凡小鼠VSMCs的具体调控作用，检测白藜芦醇对VSMCs的凋亡反应影响，结果表明白藜芦醇可明显促进VSMCs的凋亡反应进而抑制VSMCs的增殖水平，最终改善MFS动脉瘤的形成。

而VSMCs凋亡具体作用机制可受促凋亡基因Bax和抗凋亡基因Bcl-2调控。研究证实Bax/Bcl-2的增加可改变线粒体膜通透性和调节细胞色素C的释放，进而明显促进凋亡反应[15]。因此，掌握Bax和Bcl-2之间的平衡则为调控VSMCs凋亡机制的关键。本研究已验证白藜芦醇可通过上调促凋亡蛋白Bax的表达进而促进MFS的VSMCs凋亡反应，同时也抑制VSMCs的增殖反应，最终改善MFS动脉瘤病理过程。此外，TGF-β信号通路在MFS的主动脉中明显激活，而有效抑制TGF-β信号通路可明显抑制MFS病人主动脉扩张[16]。已有研究验证白藜芦醇可通过抑制TGF-β信号通路诱导细胞凋亡反应[17]。因此，根据本实验结果，推测白藜芦醇可能通过抑制TGF-β信号通路进而调控VSMCs的存亡，最终改善MFS动脉瘤的形成。

综上所述，白藜芦醇可通过上调促凋亡基因Bax的表达进而促进VSMCs的凋亡反应，同时抑制VSMCs的增殖水平，最终可改善马凡小鼠动脉瘤的病理发展过程。