人乳腺癌原代细胞组织块培养方法的改良及其鉴定

王 敏，陆 祥，曾 峰，檀 军，侯泽宇，陈 伟

(1.遵义医科大学 组织胚胎学教研室，贵州 遵义 563099；2.贵州中医药大学第一附属医院，贵州 贵阳 550001；3.遵义医科大学第一附属医院，贵州 遵义 563099)

乳腺癌是女性最为常见的恶性肿瘤，全球每年新发乳腺癌约167.1万人，年死亡人数约52.2万计[1]。乳腺癌是五大常见癌症其中之一，也是全球女性最常见的癌症死亡原因[2-4]。乳腺癌的发病机制尚不明确[5]，治疗方法尽管不尽相同，但结果却大同小异，依然呈现出高复发、高转移和高死亡率等特点[6]。所以，建立体外的原代人乳腺癌细胞培养模型，用于人乳腺癌细胞分子生物学特征的研究，其重要性日显突出。研究表明，原代培养人乳腺癌细胞的常见方法包括组织块贴壁法、酶消化法和细胞培养法，与酶消化法和细胞培养法相比较，组织块贴壁法实验成本更低廉，细胞存活率更高[7]。但其在实际应用中也存在自身的缺点，如易污染，在剪碎组织培养细胞过程中，易造成组织损伤及失活，不利于细胞爬出，耗时较长等，尤其是成纤维细胞的生存和适应能力强，较早于肿瘤细胞从组织块中爬出，进一步包绕组织块导致肿瘤细胞难以爬出，少量癌细胞爬出后也很难完全去除成纤维细胞，纯化方法不易操作而导致培养失败[8]。针对这些问题，本研究采用改良的组织块培养方法将乳腺癌组织块中的癌细胞分离、纯化、进行体外培养，期望在体外培养高纯度的原代人乳腺癌细胞，为后续体外实验研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 人乳腺癌组织标本来源 收集2017年6月至2019年4月遵义医科大学第一附属医院甲乳外科10例乳腺癌患者的新鲜癌组织标本。在无菌条件下，切取癌组织标本约1cm×1cm×1cm大小，放入无菌装有平衡盐的离心管中，在冰桶中迅速带回实验室。术后经病理诊断均为乳腺导管原位癌，患者年龄在28～56岁，术前均未进行放化疗，本研究征得患者或家属知情同意，符合伦理学规范。

1.1.2 主要试剂与仪器 DMEM培养基(Hyclone，美国)；胎牛血清(Hyclone，美国)；CO2培养箱(Thermo Forma，美国)；CA153兔抗人多克隆抗体(proteintech group，美国)；现配0.25%胰蛋白酶(Hyclone，美国)；Asinvert200倒置显微镜(Nikon，日本)；流式细胞仪(BD，美国)。

1.2 方法

1.2.1 分组培养人乳腺癌原代细胞 ①在超净工作台内，用4℃预冷的PBS冲洗组织块，洗净组织块上的血迹，并用眼科剪去除坏死组织和脂肪组织；②将乳腺癌组织块平均分成0.5cm×1cm×1cm大小的两份，随机标记为改良组和传统组；③在含有20%胎牛血清的DMEM的培养皿中用眼科剪剪成约0.5～2 mm3的碎片；④组织碎片铺在培养瓶里，每个组织间距为0.3 cm；⑤改良组加少量含20%胎牛血清的DMEM在培养瓶中，不没过组织块为准(25 cm2培养瓶约放1.5 mL培养液)，正置在孵箱中培养；传统组加少量纯胎牛血清湿润瓶壁后，再放入剪碎的组织块，倒置培养瓶在孵箱1～2 h后，再正置培养瓶，沿培养瓶边缓慢加入适量的含20%胎牛血清的DMEM，放置于37℃恒温，CO2浓度为5%，湿度为95%的孵箱中培养[15]；⑥隔日换液，观察人乳腺癌原代细胞爬出时间、爬出数量及贴壁生长情况。

1.2.2 组织块培养7d后贴壁细胞总量计数 组织块培养7d后，在超净台中，转移组织块至其他培养瓶继续培养，用0.25%胰酶消化贴壁细胞，至贴壁细胞完全脱落，重悬细胞并计数，倒置相差显微镜下用细胞计数板计数每毫升细胞悬液中的细胞数，重复3次。细胞总量=每毫升细胞数×细胞悬液的体积。

1.2.3 纯化人乳腺癌原代细胞 改良组贴壁人乳腺癌原代细胞铺满瓶底50%左右时，用延长胰酶消化时间差法一次性纯化原代细胞，方法：用0.25%胰酶处理贴壁细胞5～6 min，当长梭形的成纤维细胞在培养瓶中完全消化脱落，而不规则形的人乳腺癌原代细胞仍然附着在培养瓶上时，轻轻吸出瓶内胰酶并用PBS冲洗，然后再用0.25%胰酶消化人乳腺癌原代细胞，并将其转移至新的培养瓶培养；传统组贴壁人乳腺癌原代细胞铺满瓶底80%～100%时，用反复酶消化时间差法纯化原代细胞，方法：用0.25%胰酶处理贴壁细胞2～4 min，先消化一部分成纤维细胞后，再重复上述操作，直致去除成纤维细胞，然后再用0.25%胰酶消化人乳腺癌原代细胞，并将其转移至新的培养瓶培养[15]。

1.2.4 免疫组化鉴定两组人乳腺癌原代细胞 通过人乳腺癌特异性分子CA153[10]的阳性表达鉴定原代细胞，方法如下：①利用所培养的两组人乳腺癌原代细胞制作爬片，取出后，PBS洗3遍，每次3分钟。4℃冷丙酮固定10 min，干燥30 min。② 用PBS洗3次，每次5min，加3%过氧化氢30μL，室温孵育10 min，蒸馏水冲洗，PBS洗3次，每次5min。③加1%的Triton X-100 30μL，室温孵育10 min，蒸馏水冲洗，PBS洗3次，每次5min。④滴山羊血清30μL，室温孵育30 min，倾去勿洗。⑤滴加稀释后(1∶100)兔抗人多克隆CA153一抗抗体，空白对照组以PBS代替一抗，4℃湿盒孵育过夜。PBS洗3次，每次5min。⑥滴加生物素标记的二抗工作液30μL，室温孵育30 min。PBS洗3次，每次5min。⑦滴加辣根酶标记链酶卵白素30μL，室温孵育30 min。PBS洗3次，每次5min。⑧滴加DAB显色剂30μL，显微镜下观察显色，自来水冲洗。⑨苏木精染液染色2 min，自来水洗，迅速过盐酸酒精溶液，自来水洗，过氨水溶液，自来水洗。⑩梯度酒精脱水。二甲苯透明。中性树胶封片，明场拍照。

1.2.5 流式细胞术比较两组人乳腺癌原代细胞纯度 原代细胞用0.25%胰酶消化后取约1×106个细胞用4%多聚甲醛过夜固定，PBS洗涤2次后，传统组和改良组分别加入兔抗人CA153[10]抗体(1∶100)室温孵育45 min 。PBS洗涤2次后分别加入荧光标记的山羊抗兔二抗(1:50)4℃避光孵育30 min，PBS洗涤2次后重悬细胞，采用美国BD公司流式细胞仪 (Flow Cytometry)进行检测。

1.2.6 纯化后细胞贴壁生长观察及细胞活性检测 倒置显微镜下分别观察纯化1、2、3d后人乳腺癌原代细胞的生长情况。在细胞计数后，调整细胞浓度为1×105个/mL，接种于96孔板中，每孔100 μL，CO2培养箱培养48 h，去除培养液，每孔加入20μL的MTT溶液，孵育4 h后，每孔加入150 μL的DMSO溶液，振荡10 min，使用酶标仪测得570 nm处吸光度值(OD值)。取3个孔的均值。

2 结果

2.1 两组原代细胞爬出时间、爬出数量及贴壁生长情况 改良组和传统组组织块贴壁1d后，有活性的乳腺癌组织块均能紧密贴壁，倒置显微镜下观察，组织块透光性差，呈现为暗黑色遮光区域(见图1红色箭头)；改良组培养1d后见周围有大量单个细胞游出，圆形、体积小、折光性强(见图1～a1黑色箭头)，3d后见部分细胞散在贴壁，5d后见大部分细胞贴壁生长，贴壁细胞胞核较大，核明显，融合生长，相互衔接呈典型的“铺路石”状，铺满瓶底50%左右(见图1-a5黑色箭头)，培养7d贴壁细胞融合成一片(见图1-a7)；而传统组1d后见少量单个圆形细胞爬出(见图1-b1黑色箭头)，5d后见部分细胞贴壁(见图1-b5黑色箭头)，培养7d后，部分原代细胞融合生长，仅铺满瓶底30%左右(见图1-b7)，见图1。

a1～a8：分别代表改良组培养1～8d； b1～b8：分别代表传统组培养1～8d；红色箭头：贴壁组织块，黑色箭头：原代细胞。图1 两组原代细胞爬出时间、爬出数量及贴壁生长情况(×100)

2.2 组织块培养7d后贴壁细胞总量 组织块培养7d后，改良组织块培养法明显比传统组织块培养法获得的贴壁细胞数多。改良组所得贴壁细胞总数约为(9.88±0.20)×105个，而传统组所得贴壁细胞总数约为(4.88±0.21)×105个，差异有统计学意义(P<0.001，见图2)。

**：与传统组比较，P<0.001；n=3。图2 组织块培养7d后获得的贴壁细胞总量

2.3 人乳腺癌原代培养细胞的鉴定 人乳腺癌原代细胞纯化后经CA153染色，显微镜下可见两组原代培养细胞胞核和胞浆染成棕色，证实细胞为乳腺癌细胞(CA153蛋白)。非乳腺癌细胞胞核和胞浆未被染成棕色，传统组见少许未被染色细胞(见图3)。

2.4 两组人乳腺癌原代细胞纯度比较 改良组原代人乳腺癌细胞特异性抗体CA153阳性表达率(99.13±0.06)%，明显高于传统组阳性表达率(75.72±4.96)%。，差异有统计学意义(P<0.05，见图5)。

2.5 纯化后人乳腺癌原代细胞贴壁生长情况 倒置显微镜下观察，改良组纯化1d后乳腺癌原代细胞可铺满瓶底50%左右，细胞胞质展开，体积大小不一，融合成片贴壁生长，细胞折光性好，2d后，原代细胞融合成片相互衔接后呈典型的“铺路石”状，铺满瓶底80%，3d后细胞结合紧密,生长分裂旺盛；而传统组纯化1d后细胞仅铺满瓶底20%左右，仍可见梭形的成纤维细胞贴壁，2d后，细胞铺满瓶底30%左右，3d后，贴壁细胞融合成片，铺满瓶底约60%，镜下可见梭形成纤维细胞贴壁生长(见图6)。

黑色箭头：人乳腺癌原代细胞；红色箭头：非人乳腺癌原代细胞(a1、b1×100，a2、a3、b2、b3×400)。图3 人乳腺癌原代细胞CA153阳性表达

图4 流式细胞术鉴定、比较人乳腺癌原代细胞纯度

2.6 纯化48h后贴壁人乳腺癌原代细胞的活性 两种方法获得纯化48h后贴壁原代细胞的活性，通过吸光度值OD代表。传统组细胞OD值为(0.47±0.01)，改良组OD值为(0.86±0.03)，差异有明显统计学意义(P<0.001，见图7)。

*：与传统组比较，P<0.05；n=3。图5 流式细胞术比较两组人乳腺癌原代细胞纯度

a：改良组，b：传统组。图6 纯化后人乳腺癌原代细胞贴壁生长情况(×100)

**:与传统组比较，P<0.001；n=3。图7 纯化48h后贴壁人乳腺癌原代细胞的活性

3 讨论

人乳腺癌原代细胞组织块培养法是从乳腺癌患者癌组织中分离人乳腺癌原代细胞，生物学特性变化不大，最大程度保留原来的遗传特性，也最接近其在体内的生长特性，适宜做各种实验研究[11]。常用培养原代细胞的方法有酶消化法、细胞培养法和组织块贴壁法，因酶消化培养法的消化时间不易控制，易导致培养失败[12]，而有学者对细胞培养法和组织块培养法比较，结果组织块培养法的成功率为90.0%，细胞培养法的成功率为20.0%[13]。从而得出结论，组织块培养法是较好最常用的原代培养方法。但其在实际应用中也存在着本身的缺点，成纤维细胞难以去除，培养时间长等缺点[14]。针对这些问题，本研究采用改良的组织块培养和纯化方法，将乳腺癌组织块中的癌细胞分离、纯化、进行体外培养，成功在体外培养了高纯度的原代人乳腺癌细胞。

传统的组织块培养方法中，将剪碎的组织块倒置放入孵箱1～2h后，再行常规培养，这种操作，虽然增加了组织块的贴壁牢固度，但是易造成组织细胞失活，影响细胞爬出数量，最终易导致培养失败[15]。改良组织块培养方法，常规剪碎组织块后，将剪碎的组织块放入少量含20%胎牛血清的DMEM培养瓶，正置培养瓶于孵箱中4～6h后，观察组织块贴壁后，再适当滴入几滴培养液，持续观察培养液的量及组织块贴壁情况。传统组织块培养纯化原代细胞中，常规等原代细胞铺满瓶底>80%时，再用胰酶消化时间差法纯化原代细胞，然而此时成纤维细胞易老化，不易被消化，用反复胰酶消化时间差法，仍不能达到纯化的目的，不仅会影响细胞活性，而且因原代人乳腺癌细胞纯度低，成纤维细胞生长迅速而抑制原代乳腺癌细胞生长，导致不能获得足够的细胞数量进行后期实验，所以改良后的纯化方法是原代细胞铺至50%左右时，即用胰酶消化时间差法一次性纯化原代乳腺癌细胞，降低纯化难度的同时，细胞活性好，不仅减少了反复胰酶消化降低细胞活性，并且减少了细胞污染的概率，高效快速获得高纯度乳腺癌细胞。

在实验过程中，经过多次探索发现有以下几点需要注意：①取材：尽量在癌组织丰富的区域取材，放入含有转运液的无菌离心管中，在冰桶中带回实验室，尽快开始实验，间隔时间应不超过4 h；②剪切：剪切过程要在冰袋上完成，降低细胞代谢，尽可能的去除脂肪组织和血迹，剪碎组织时间应控制在10 min内；③使用改良组织块培养法，正置培养瓶在孵箱中培养时，培养液一定不能没过组织块，组织块贴壁才能确保细胞能从组织块中爬出，隔天换液一次，原代细胞铺满瓶底50%时，进行纯化；④24 h后换液，未贴壁的原代细胞仍有贴壁的可能，可以收集继续培养；⑤纯化后如细胞量不多，可放在12孔板中培养，传代后再放入培养瓶中继续培养。

综上所述，本文所介绍的改良组织块培养法可以获得活力好、纯度高的人原代乳腺癌细胞，且培养纯化时间明显缩短，是一种较好的培养人乳腺癌原代细胞的方法，为后期乳腺癌原代细胞的研究建立了良好的基础。