食管癌组织中溶酶体相关膜蛋白2a的表达及其临床意义

闵燕飞, 黄 荣, 蒋 军, 何 瀚

(广东省佛山市第一人民医院 胸腹放疗科, 广东 佛山, 528000)

食管癌是中国常见消化系统恶性肿瘤，其发病率呈逐年递增趋势，其发生与发展受到多种因素调控[1-2]。随着现代医学及分子生物学的不断进步，食管癌的临床诊断和发病机制的研究越来越深入[3]。溶酶体相关膜蛋白2(LAMP2)是溶酶体膜蛋白家族的统称，其包括LAMP2a、LAMP2b和LAMP2c 3种剪接变异体[4-5]。研究[6]发现, LAMP2a具有维持溶酶体膜的完整性和稳定内环境酸碱度的功能，其通过分子伴侣自噬调节细胞内的自噬活性，进而在肿瘤的发生、发展演变过程中发挥重要作用。研究[7]证实LAMP2a在多种恶性肿瘤中表达异常，其表达升高可能有促进肿瘤发生、发展的作用，而LAMP2a在食管癌中的作用仍不明确。因此，本研究通过收集食管癌患者组织标本，采用免疫组化技术检测食管癌中LAMP2a的表达，并分析LAMP2a表达与临床病理特征的相关性，以此探讨LAMP2a在食管癌发生、发展中的意义，旨在为食管癌的早期诊断及治疗靶点选择提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2016年 8月—2018年4月本院行手术切除的食管癌患者58例的组织标本。患者男46例，女12例，年龄34～72岁，平均(58.6±6.3)岁。术后病理检查由2名病理科医师采用双盲法检查确诊。所有患者术前均未行放化疗及免疫因子等治疗。食管癌患者中高分化16例，中分化31例，低分化11例; 依据1997年国际抗癌联盟(UICC)制定的TNM分期标准对食管癌进行分期: T17例, T214例, T329, T48例; N028 例, N130例; M047例, M111例; Ⅰ期8例，Ⅱ期29例，Ⅲ期21例。从食管断端距瘤缘约10 cm处取10个正常食管组织标本，均经病理检查确认为正常组织。通过来院和电话随访对术后患者进行随访，随访时间自患者手术之日至末次随访所得的截尾时间为准，随访截止时间为2019年5月。

1.2 免疫组织化学分析

1.2.1 免疫组化采用经典的SP法: 使用石蜡标本连续制作未染色的4 μm切片。按免疫组化SP法试剂盒说明书进行实验: 将切片置于60 ℃恒温箱中烘烤120 min, 随后进行脱蜡和水化，蒸馏水冲洗2次每次5 min; 将切片放入盛有0.01 mol/L枸橼酸缓冲液置于微波炉内加热10 min进行抗原修复；用3% H2O2滴加到切片上，封闭5～10 min去除内源性过氧化物酶且使用10%血清封闭15 min。滴加兔单克隆抗LAMP2a (D5C2P)抗体(1∶100; #49067 CST)4 ℃过夜孵育，次日PBS洗涤再行二抗孵育30 min。最后, DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片镜检; 采用等量PBS代替一抗为阴性对照。切片染色完成后进行结果判定。

1.2.2 免疫组化染色结果判定: LAMP2a免疫反应阳性细胞为黄色或棕褐色，主要定位于细胞质上。根据与阴性及阳性对照对比，评判阳性结果以及阳性率。采用Tanaka等提出的计分评判标准进行判断。染色强度评分: 0分为无着色，与背景色一致; 1分为浅黄色，略高于背景色; 2分为棕黄色，明显高于背景色; 3分为棕褐色。按阳性细胞所占比率进行评分: 0分为阴性; 1分为<10%; 2分为10%～50%; 3分为>50%～75%; 4分为>75%。染色强度得分与阳性细胞所占比率得分的乘积判定LAMP2a阳性表达结果: 0～2 分为阴性(-); 3～4 分为弱阳性(+); 5～8 分为中度阳性(); 9～12 分为强阳性()。

1.2.3 结果分析: 使用LeicaQ570c图像分析系统对切片组织进行图像分析，每张切片至少选择5个高倍镜视野(放大倍数400倍)进行定量灰度扫描，扫描后再做分析。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 20.0进行统计学分析，食管癌组织和正常食管黏膜组织LAMP2a蛋白表达水平采用独立样本t检验，多组间计量资料比较用方差分析相关性; 各组间率的比较采用χ2检验; 绘制Kaplan-Meier曲线进行生存分析并采用Log Rank检验方法，运用单因素分析及Cox回归多因素分析明确影响食管癌患者预后的相关危险因素。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 LAMP2a在食管癌组织中表达

采用免疫组织化学染色法测定了LAMP2a在不同恶性程度食管癌和正常食管黏膜组织样本中表达水平和亚细胞定位。LAMP2a蛋白免疫组化染色法显示，其亚细胞定位于细胞质中，染色呈黄色或棕褐色。LAMP2a在正常食管黏膜呈弱阳性表达，在中等分化的食管癌组织中呈阳性表达(+), 在低分化食管癌组织中呈强阳性表达(); LAMP2a在食管癌组织中的阳性表达率为72.41%(42/58), 见图1。

2.2 LAMP2a在食管癌组织中表达与临床病理

特征的关系

LAMP2a阳性表达率与性别(P=0.740)、年龄(P=0.590)和淋巴结转移(P=0.188)无显著相关性，差异无统计学意义(P>0.05); 但与肿瘤临床分期(P<0.001)、T分期(P=0.043)及分化程度(P=0.018)呈显著相关性。见表1。

2.3 LAMP2a蛋白表达与患者预后关系

LAMP2a表达阳性的食管癌患者总生存率显著低于表达阴性患者组(Log-rank检验χ2=13.87,P<0.0001), LAMP2a表达阳性的食管癌患者疾病无进展生存率显著低于LAMP2a表达阴性患者(χ2=12.80,P<0.0001), 见图2。

A、D: LAMP2a在正常食管黏膜的基底层上皮细胞和基质成纤维细胞中呈弱阳性; B、E: LAMP2a在中等分化癌细胞中呈中等阳性表达(+); C、F: LAMP2a在低分化食管癌癌细胞中呈弥漫强阳性表达()。

表1 食管癌组织中LAMP2a的表达与临床病理特征的相关性[n(%)]

A: LAMP2a低表达与高表达患者总生存率比较; B: LAMP2a低表达与高表达患者疾病无进展生存率比较。

图2 LAMP2a的表达对食管癌患者总生存率及疾病无进展生存率的影响

2.4 食管癌患者预后的Cox模型单因素及多因素分析

将年龄、性别、临床分期、分化程度、TNM分期及LAMP2a蛋白表达强制引入Cox比例风险模型，进行单因素及多因素分析。单因素分析结果表明，临床分期、淋巴结转移和LAMP2a蛋白表达是食管癌患者预后的影响因素(P<0.05)。多因素分析发现，临床分期、淋巴结转移和LAMP2a蛋白表达是食管癌患者预后的独立影响因素(P<0.05)。见表2。

表2 食管癌患者预后Cox模型单因素及多因素分析

3 讨 论

近年来，中国食管癌发病率呈逐年升高的趋势，严重危害人类健康[8]。因此，发现一些新的生物学标志物对食管癌患者早期诊断及预后的评判具有至关重要的意义[9]。

LAMP2a编码溶酶体相关的膜蛋白，其定位于人染色体Xq24上。研究[10]发现, LAMP2a在人的胎盘、肺及肝脏等多种器官或组织中高表达，其具有维持溶酶体膜的完整性、内环境稳态及代谢平衡等多种功能。LAMP2a作为分子伴侣介导的自噬(CMA)的限速蛋白，其下调导致CMA阻滞，而CMA的激活与肿瘤进展密切有关[11]。有研究报道, LAMP2a在肺癌[12]、肝癌[13]、胃癌[14]、乳腺癌[15]及前列腺癌[16]等多种恶性肿瘤中异常表达，和肿瘤的发生、发展关系紧密。研究证实，CMA是肺癌细胞增殖所必需的，CMA激活被证明是维持糖酵解增强以满足快速增殖的生物能量所需的必要条件。Kon M等[17]采用siRNA干扰技术沉默肺癌细胞中LAMP2A的表达，结果发现，沉默LAMP2A后阻断CMA的激活，从而引起GAPDH和PGK糖酵解酶的转录抑制，进而导致糖酵解和ATP产生减少，抑制肝癌细胞增殖。蔡维乐等[18]研究表明，采用慢病毒转染技术构建LAMP2a干扰的肝癌细胞模型, HepG2细胞增殖受抑制，PI3K、AKT和NF-κB p-p65等信号通路关键蛋白表达水平明显下调，提示LAMP2a可能是通过影响PI3K/AKT和NF-κB信号通路抑制肝癌细胞生长和增殖。Zhou JF等[19]同样发现，敲除胃癌细胞中的LAMP2a基因后，细胞增殖速率明显受限，并且发现LAMP2a表达水平与胃癌患者不良预后呈相关，即LAMP2a表达越高，患者预后越差。Han Q等[20]研究报道LAMP2a在人类乳腺癌组织高表达，其表达水平也与乳腺导管癌的组织学分级呈正相关。LAMP2a高表达也预示着乳腺癌患者的总生存率较低。进一步研究发现，通过敲除LAMP2a基因的表达后, CMA活性明显下调，并显著抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468的生长和转移，而过表达LAMP2a后, CMA活性则明显上调，提示LAMP2a在乳腺癌中高表达，其可能是通过影响CMA的活性从而发挥促进或抑制肿瘤的发生发展进程。

本研究采用免疫组化技术结果发现, LAMP2a蛋白主要定位于细胞质中，染色呈黄色或棕褐色; LAMP2a在正常食管黏膜组织中低表达，在食管癌组织中呈高表达，其表达水平与与肿瘤临床分期(P<0.001)、T分期(P=0.043)及分化程度(P=0.018)密切相关，但与性别(P=0.740)、年龄(P=0.590)和淋巴结转移(P=0.188)无显著相关性。提示其在食管癌发生发展过程中发挥了重要作用，并由此促进了疾病进展。通过对食管癌患者进行随访, Kaplan-Meier生存分析表明, LAMP2a表达阳性的食管癌患者总生存率和疾病无进展生存率均显著低于表达阴性患者组(P<0.001)。LAMP2a表达越高，预后越差, LAMP2a表达与患者不良预后呈负相关。Cox比例风险模型结果表明肿瘤浸润深度和LAMP2a蛋白表达是食管癌患者独立危险因素(P<0.05)。本研究结果与Zhou JF等[19]的结果一致，其发现LAMP2a在女性食管癌和胃癌患者中的表达越高，患者不良预后越差；本研究单因素及多因素分析结果表明，临床分期、淋巴结转移和LAMP2a蛋白表达是食管癌患者预后的影响因素(P<0.05)。多因素分析发现，临床分期、淋巴结转移和LAMP2a蛋白表达是食管癌患者预后的独立影响因素。

本研究受样本量限制，可能会造成抽样误差等情况。同时，本研究未清楚阐明LAMP2a在食管癌中的调控作用及分子机制，有待进一步研究和探讨。综上所述, LAMP2a在食管癌组织中显著高表达，其表达水平与与肿瘤临床分期、T分期及分化程度密切相关，且预示患者预后较差。提示LAMP2a可能参与了食管癌的发生、发展进程，能够为食管癌的诊断及预后评判提供重要依据。