中华猕猴桃根提取物对肝癌细胞Bel-7402的放疗增敏作用

邢海洋, 张砚迪, 王可心, 阚 亮

(中国医科大学附属盛京医院, 1. 放疗中心; 2. 老年病科, 辽宁 沈阳, 110022)

中华猕猴桃根属于猕猴桃科植物，在中国的主要生长地包括杭州、温州等城市的南部区域[1], 其在祛风除湿、清热解毒、活血消肿方面具有良好的效果。当代药理学研究[2]显示，猕猴桃根对于消化系统、呼吸系统恶性肿瘤(如食管癌、胃癌、肺癌等)具有较好的治疗作用，此外对乳腺癌也有较好的效果，拥有广泛的抗癌细胞活性。随着对猕猴桃根有效成分和药理功效的研究[3-4]不断深入，从中华猕猴桃根中提炼出生物碱类、黄酮类、三萜类、蒽醌类、苯丙素类等多种成分，这些化学活性成分可有效发挥抗癌作用[5-6]。2018年2月—2019年11月，作者观察了中华猕猴桃根提取物对肝癌细胞Bel-7402的放疗增敏作用，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 猕猴桃根的提取和分离

选用产自浙江省金华市的猕猴桃根，将500 g干燥产物粉粹后，进一步采用2 L甲醇回流，共计回流3次; 过滤并真空干燥后，溶解于蒸馏水中。水相提取物分别应用氯仿、正丁醇、乙酸乙酯提取3次，最终获得氯仿组分、正丁醇组分和乙酸乙酯组分。氯仿组分进一步利用H60硅胶柱层析(长25 cm, 内直径5 cm), 选取氯仿，甲醇梯度(50∶1, 20∶1, 10∶1, 5∶1, 2∶1, 1∶1, 200 mL/次)洗脱，烘干，并置于4 ℃冰箱备用。

1.2 细胞培养及传代

购买肝癌细胞Bel-7402株，将其传代、培养于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，同时加入100 mg/L链霉素、1×105U/L青霉素，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。选取处于对数生长期的肝癌Bel-7402细胞用于下一步实验。

1.3 流式细胞仪检测Bel-7402细胞的凋亡

将对数生长期的肝癌Bel-7402细胞接种于含有8×104个/孔的含有完全培养基2 mL的6孔板中，随后置于37 ℃、5%CO2培养箱中24 h, 直至细胞贴壁后吸去培养基。采用6 MV X射线进行Bel-7402细胞照射，射野范围10 cm×10 cm, 皮距100 cm。设0、1、2、3、4、6 Gy共6个剂量点，依次分为单纯放疗组、单纯药物组和联合放疗组。联合放疗组在放疗的同时加入2 mL终浓度为160 μg/mL的猕猴桃根提取物完全培养液，接种的细胞数与单纯放疗组相比适量提高，且与照射剂量呈正相关。将上述细胞放置于培养箱中培养，培养72 h后收集贴壁细胞和上清液，并将其置于15 mL离心管中，采用PBS预冷洗涤2次, 1 000 转/s离心5 min后，弃掉上清。每组接下来再分别加入100 μL buffer, 然后吹打均匀后各加入5 μL 碘化丙啶(PI)、5 μL AnnexinV, 常温条件下进行染色0.5 h, 注意避光。之后2组依次再次加入300 μL buffer, 应用200目滤网过滤细胞，并将其收集于2 mL圆底EP管中。每个样品的1万个细胞通过流式细胞仪采集荧光强度数据，采用525 nm作为检验波长, 488 nm激光作为激发波长。实验重复3次。

1.4 Hochest33258染色观察野生猕猴桃根提取物对肝癌细胞Bel-7402形态的影响

采用70%乙醇浸泡盖玻片过夜后，置于含8×104个/孔的6孔板中，每孔加2 mL完全培养基，放置于培养箱中培养24 h, 等待细胞贴壁后吸去培养基，用6 MV X射线进行细胞照射，射野范围10 cm×10 cm, 皮距100 cm。设0、1、2、3、4、6 Gy共6个剂量点，分为单纯放疗组、单纯药物组和联合放疗组。联合放疗组在放疗的同时加入2 mL终浓度为160 μg/mL的猕猴桃根提取物完全培养液，接种细胞数较单纯放疗组适当提高，且与照射剂量呈正相关。放置于培养箱中再次培养48 h后，按照染色试剂盒步骤进行操作，在发射波长约460 nm、荧光激发波长约350 nm的荧光显微镜下观察并比较细胞核形态。

1.5 存活分数及细胞存活曲线

采用6 MV X射线行细胞照射，射野范围10 cm×10 cm, 皮距100 cm。设0、1、2、3、4、6 Gy共6个剂量点，分为单纯放疗组和联合放疗组。联合放疗组在放疗的同时加入2 mL终浓度为160 μg/mL的猕猴桃根提取物完全培养液，接种细胞数较单纯放疗组适当提高，且与照射剂量成呈相关多。相互作用72 h后，用PBS洗涤以去掉猕猴桃根提取物完全培养液，培养14 d后染色，并进一步计数克隆数。

存活分数=某一剂量联合放疗组克隆形成率/单纯放疗组克隆形成率。将照射剂量作为横坐标(线性坐标)，存活分数作为纵坐标(对数坐标)，得到设定下的细胞存活曲线。

2 结 果

2.1 不同加药浓度对细胞凋亡的影响

流式细胞仪结果显示，与单纯放疗组、单纯药物组相比，联合放疗组Bel-7402凋亡细胞的比例显著增多(Q4区细胞数明显增加)。从凋亡细胞分布情况进行分析，药物主要引起中、晚期Bel-7402细胞凋亡和坏死，对早期细胞凋亡无明显影响。见图1。

A: 单纯药物组细胞凋亡情况; B: 单纯放疗组细胞凋亡情况; C: 联合放疗组细胞凋亡情况。

图1 不同加药浓度对细胞凋亡的影响

2.2 Hocheset33258染色下不同加药浓度对细胞核形态的影响

通过Hocheset33258染色显示出不同加药浓度对细胞核形态变化的影响，单纯药物组细胞核表现为染色均匀，轮廓清晰完整，核膜光滑，同时可以观察到分裂期细胞核的变化; 单纯放疗组细胞核中可见固缩的染色质，并且呈现出浓染致密的蓝色，同时可以观察到细胞核的碎裂; 与单纯放疗组相比，联合放疗组正常细胞数量逐渐减少，而凋亡细胞数量逐渐增多，说明野生猕猴桃根提取物对肝癌细胞Bel-7402的放疗具有增敏作用。见图2。

A: 单纯药物组细胞形态; B: 单纯放疗组细胞形态; C: 联合放疗组细胞形态。

图2 Hocheset33258染色下不同加药浓度对细胞核形态变化的影响(放大倍数100倍)

2.3 单纯放疗组与联合放疗组细胞存活曲线

与单纯放疗组相比，联合放疗组细胞存活曲线显示细胞存活分数明显降低，表明中华猕猴桃根提取物对肝癌细胞Bel-7402具有放疗增敏作用。见图3。

图3 单纯放疗组与联合放疗组细胞存活曲线

3 讨 论

放疗是治疗肝癌的常用方法，但其疗效欠佳[7-8], 究其原因为放疗对正常肝脏组织的损害限制了放疗剂量，患者的放疗耐受性也较差。因此，增加放疗过程中肿瘤细胞对射线的敏感性，同时减少放疗对肝脏及其临近器官的损害，是提高放疗疗效的关键[9-10]。本研究以中华猕猴桃根提取物作为肝脏恶性肿瘤细胞Bel-7402的放疗增敏剂，结果显示中华猕猴桃根提取物对Bel-7402细胞有放疗增敏功效，其机制与诱导细胞凋亡有关。

选用160 μg/mL作为猕猴桃根提取物完全培养液的放疗增敏浓度，是因为该质量浓度表现

出较高的细胞凋亡率。通过细胞存活曲线可以看出，放疗增敏作用在160 μg/mL质量浓度时有较好的体现。放疗和160 μg/mL猕猴桃根提取物完全培养液联合应用，一方面可以使细胞存活曲线的平均致死剂量变小; 另一方面表现为细胞存活曲线肩区明显狭窄。上述结果表明，中华猕猴桃根提取物对肝脏恶性肿瘤细胞Bel-7402有放疗增敏功效，考虑原因可能为中华猕猴桃根提炼物具有直接抗癌功效，与放疗联合应用具有协同作用，而中华猕猴桃根提炼物还可以诱导细胞凋亡。