急性心肌梗死病人血清miR-29b和miR-424的表达水平及其与预后的关系

刘志立，宋 菊，焦亚洲

急性心肌梗死是冠状动脉急性或持续性缺血缺氧引起心肌缺血的一类冠状动脉粥样硬化性心脏病，其主要特点为发病迅速、病情发展快及死亡率高等。近年来，我国急性心肌梗死的发病率逐渐升高，相关研究表明心肌细胞或心血管疾病的发生与炎性因子的异常表达有关，但关于炎性因子与上游基因的相关调节机制尚未明确[1]。近年来有关研究表明MicroRNAs(miRNAs)对心肌细胞的功能具有调节作用，在急性心肌梗死发病过程中可发挥纤维化与抗纤维化作用，且某些miRNAs可调控体内多种基因的表达[2]。还有研究表明miR-29b可抗心脏纤维化并改善心功能[3]。miR-424是长度为19～25 nt的一类内源性非编码RNA，通过调控血管生成过程并参与多种疾病的发生发展而影响个体发育[4]。目前关于血清miR-29b与miR-424表达水平与急性心肌梗死相关性的研究相对较少，本研究探讨急性心肌梗死病人血清miR-29b与miR-424表达水平及其与预后的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年12月—2015年5月我院收治的96例急性心肌梗死病人为研究组，另选取同期96名健康者为对照组。对照组，男47名，女49名，年龄49～72(60.24±7.65)岁。研究组，男46例，女50例，年龄50～75(61.14±9.23)岁，发病时间1～12(6.02±1.53)h。两组研究对象的性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经我院伦理委员会批准。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：符合急性心肌梗死诊断的相关标准[5]；发病时间≤12 h者；受试人员知情且签署知情同意书。排除标准：患有严重心肌病者；严重肝肾功能衰竭者；患有自身性免疫疾病者；近期有重大手术者。

1.3 检测方法

1.3.1 仪器与试剂 miR-29b、miR-424及U6引物由广州Invitrogen公司合成；RNA提取试剂盒订购于北京生化科技有限公司；反转录试剂盒购于Thermo scientific公司，SYBR Green RCR masrer mix与Trizol选购于美国Invitrogen公司，荧光定量PCR仪购于ABI公司，NanoDrop 2000超微量核酸测定仪来自美国Thermo公司，试验所用其他试剂均来自Takara公司。

1.3.2 血样采集 急性心肌梗死病人于入院后采集外

周静脉血5 mL，采集对照组外周静脉血5 mL，室温下静置30 min，离心10 min，放置超低温冰箱保存。

1.3.3 检测miR-29b与miR-424表达水平 提取总RNA：200 μL血清样本加入400 μL Trizol，按照Trizol法提取组织总RNA，核酸测定仪测定RNA纯度与含量，取2 μg采用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。miR-29b：上游(Forward primer，正向引物)ACGCGTCACCGAAGGTCTAAGCATTT；下游(Reversed primer，反向引物)AGATCTTGCCGTGACAGTTCAGTAGG。以U6作为内参基因，上游：CTGGTA GGG TGCT CGCT TCGGCAG，下游：CA ACTGGTGTAGTGGAGTCGGC。miR-424引物：上游：CGAAG CAGCAGCAATTCATG；下游：GTGCAGGGTCCGAGGT。实时定量PCR检测的反应体系共20 μL，SYBR Green Mix 10 μL，Forward-Primer 2.0 μL，Reverse-Primer 2.0 μL，cDNA 2.0 μL，R Nase-free dd H2O 4.0 μL，反应均设置3个生物学重复，反应条件为95 ℃ 预变性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 1 s，45个循环；72 ℃延伸10 min，反应均以U6为内参计算miR-29b与miR-424的相对表达量，采用2-ΔΔCt算法计算基因相对表达量。

1.3.4 检测炎性因子含量 第一天清晨空腹采集两组研究对象的外周静脉血4 mL，置于抗凝管中，转速为2 000 r/min，离心10 min后取血浆，-80 ℃保存，采用酶联免疫吸附法，并选用美国Ray Biotech公司生产的试剂盒测定血清中超敏C-反应蛋白(hs-CRP)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)与白细胞介素-6(IL-6)含量，酶联免疫吸附试剂盒选购于美国Ray Biotech公司。

1.4 随访 采用打电话、门诊复查等方式随访3年，记录病人有无生存进展期(progression free survival，PFS)情况。

2 结 果

2.1 两组血清中miR-29b、miR-42表达量比较 研究组血清中miR-29b表达量低于对照组，而miR-424表达量高于对照组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 两组血清中miR-29b与miR-424表达量比较(±s) 单位：U6

2.2 两组血清中炎性因子含量比较 研究组血清中hs-CRP、TNF-α及IL-6含量高于对照组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 两组血清中炎性因子含量比较(±s)

2.3 研究组病人血清中miR-29b、miR-424表达与炎性因子的关系 miR-29b表达与TNF-α呈正相关(P<0.05)，而与hs-CRP及IL-6表达水平无明显相关关系(P>0.05)。详见图1。miR-424与hs-CRP、IL-6的表达呈负相关，差异均具有统计学意义(P<0.05)，而与TNF-α无明显相关性(P>0.05)。详见图2、图3。

图1 miR-29b表达与TNF-α表达水平的相关性

图2 miR-424表达与hs-CRP表达水平的相关性

图3 miR-424表达与IL-6表达水平的相关性

2.4 研究组病人血清中miR-29b与miR-424表达的关系 利用Pearson检验急性心肌梗死病人血清中miR-29b与miR-424表达的相关性，结果显示miR-29b与miR-424呈负相关(P<0.05)。详见图4。

图4 miR-29b与miR-424 mRNA表达的相关性

2.5 研究组病人血清中miR-29b及miR-424表达水平与预后的关系 随访3年后，将病人的生存进展情况绘制Kaplan-Meier曲线图。miR-29b表达中位值为(0.21±0.04)U6，低于中位值为低表达，高于中位值为高表达，miR-29b低表达者PFS比例(47.23%)高于高表达者(21.41%)。miR-424表达量的中位值为(0.76±0.13)U6，低于中位值为低表达，高于中位值为高表达，miR-424高表达者PFS比例(42.15%)高于低表达者(15.21%)，差异均具有统计学意义(P<0.05)。详见图5、图6。将急性心肌梗死病人在随访期间的死亡结局与病人性别、年龄、血清中miR-29b与miR-424表达水平等指标进行Cox多元素回归分析，结果显示血清中miR-29b与miR-424表达均是急性心肌梗死病人死亡的危险因素。详见表3。

图5 miR-29b表达水平与PFS的关系

图6 miR-424表达水平与PFS的关系

表3 血清miR-29b、miR-424表达与病人死亡的多元回归分析

3 讨 论

急性心肌梗死是由于炎症加重、血小板活化等引起斑块破裂形成血栓并阻塞管腔造成心肌缺血而促使病人发病[6]。急性心肌梗死具有发病率高等特点，而体内炎性因子表达异常会损伤心肌细胞，研究证实血清中hs-CRP表达水平不仅可预测机体炎症反应，同时为心血管疾病的独立危险因子[7]。Niu等[8]研究表明TNF-α的含量升高能够损伤血管内皮，且与血管内皮细胞一氧化氮(NO)合成酶活性有关，而NO合成会引起血管舒张。血清中IL-6不仅参与免疫反应的细胞增殖、分化，还可与受体IL-6R结合增强巨噬细胞的功能而引起血管内皮细胞损伤[9]。虽然上述炎性因子与急性心肌梗死的发病有密切关系，但其中具体的作用机制尚未完全阐明[10]。miRNAs是真核生物中广泛存在的一种核苷酸RNA分子，可与其他蛋白结合并促进靶基因的降解或沉默而达到调控相关基因表达的目的，且参与体内多种生物学过程，研究表明心肌细胞中某些miRNAs可通过与靶mRNAs的3′UTR互补配对而调节炎性因子的表达，此外，血液循环中由心肌细胞释放miRNAs的含量变化与血清中miRNAs的含量变化相关[11]。因此，探讨血清中miRNAs表达水平对急性心肌梗死的诊疗及其具体机制的研究具有重要意义。

miR-29b属于miR-29家族，研究显示miR-29b可促使血小板衍生因子、血管内皮生长因子等转移而引发不同疾病[12]。Wang等[13]研究表明miR-29b通过与PA200依赖性蛋白激酶反应导致心血管内皮功能发生障碍。有研究发现miR-29b表达与血管平滑肌细胞由醛固酮介导的血管发病机制有关[14]。本研究通过实时荧光定量PCR法检测研究组急性心肌梗死病人与对照组健康受试人员血清中miR-29b的表达水平，结果显示研究组血清miR-29b的表达水平低于对照组，而病人血清中hs-CRP、TNF-α及IL-6水平均高于对照组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。根据miR-29b表达量的中位值将其分为高表达与低表达组，观察miR-29b表达量与血清中hs-CRP、TNF-α及IL-6表达水平的相关性，结果显示miR-29b的高表达、低表达均与TNF-α呈正相关(P<0.05)，而与其他两个炎性因子的相关性不显著(P>0.05)，说明血清中miR-29b可通过调节TNF-α表达水平而发挥一定作用，推测血清中miR-29b的表达水平可反映急性心肌梗死诊断与监测指标。

miR-424属miR-16家族，位于X染色体，研究表明miR-424不仅与肿瘤细胞的生长相关，还可调节血管生成与细胞迁移等[15]。miR-424与单核细胞及巨噬细胞的分化有关，可促进单核细胞与巨噬细胞分化并参与动脉粥样硬化的形成发展过程[16]。此外，许多研究表明miR-424可参与多种个体发育与疾病的发展进程，可通过提高丝裂原活化蛋白激酶1与细胞周期蛋白E1表达而形成异常血管[17]。文献报道miR-424可通过靶向血管生长因子、调控蛋白cyclinD1、抑制血管内皮细胞增殖，同时miR-424表达降低可促使cyclinE1的表达增加从而形成异常血管[18]。最新研究表明miR-424可促进细胞增殖并抑制细胞迁移，当心脏发生心肌缺血时miR-424则在心肌细胞中呈上调表达，从而促进新生血管的形成[19]。本研究通过实时荧光定量PCR法检测研究组与对照组血清中miR-424的表达水平，结果显示研究组血清miR-424的表达水平高于对照组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。根据miR-424表达量的中位值将其分为高表达组与低表达组，观察miR-424表达量与血清中hs -CRP、TNF-α及IL-6表达水平的相关性，结果显示miR-424的高、低表达均与hs-CRP、IL-6呈负相关(P<0.05)，而TNF-α的相关性不显著(P>0.05)，说明miR-424表达水平升高可通过降低血清中hs-CRP与IL-6表达而发挥作用。同时本研究对miR-29b与miR-424的相关性进行分析，结果显示miR-29b与miR-424呈负相关(P<0.05)，通过对急性心肌梗死病人随访3年后的死亡数量与miR-29b及miR-424表达量进行多元回归分析，结果显示miR-29b与miR-424均是其危险因素。本研究结果揭示了血清中miR-29b与miR-424的异常表达可能导致血清中炎性因子水平升高，并促使体内发生炎症反应，从而严重损伤血管内皮细胞，造成心肌缺血进一步促使急性心肌梗死的发生，miR-29b及miR-424与急性心肌梗死的病情发展及其预后密切相关，且均是急性心肌梗死病人死亡的危险因素。

综上所述，血清中miR-29b与miR-424的表达水平是否异常与诊疗急性心肌梗死及其预后密切相关，推测可作为预测筛查与监测急性心肌梗死的指标。但本研究存在一定的不足，由于多因素调节急性心肌梗死且发病机制较复杂，miR-29b与miR-424的表达水平能否适合作为急性心肌梗死筛查的监测标志物还有待进一步研究。