QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法快速测定辣椒红色素中9 种非食用色素

牛瑜琦，马晓斐，李 挥，张敬轩,，高文惠,

（1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018；2.河北冠卓检测科技股份有限公司，河北 石家庄 051130；3.河北省医疗器械与药品包装材料检验研究院，河北 石家庄 050061）

辣椒红色素是一类存在于成熟的红辣椒的果皮中的天然植物提取物着色剂，属于类胡萝卜素，具有着色力强、色泽鲜艳、保色效果好、无毒无害等优点，广泛用于食品、药品、饮料、化妆品、农副加工产品等，使用范围和市场需求日益增长，其质量安全备受关注。然而由于环境污染，工业染料存在于土壤、空气等环境中，在红辣椒的生长过程中可能会带入一些非食用色素物质，或者在储存和运输过程中污染植物；在辣椒红色素的制备过程中，伴随着提取、精制等加工过程而浓缩富集，同时非食用色素在提取过程中不易挥发、降解，从而导致在辣椒红色素中含有一定量这类有害物质，并最终转移至食品中，导致食品安全问题[1-5]。辣椒红色素基质复杂，检测干扰大，从环境可能带入的非食用色素种类多，含量低。因此，亟待需要高灵敏度、高特异性的检测技术。

目前，对于非食用色素的检测方法主要有免疫法[6-7]、电化学分析法[8-9]、薄层色谱法[10-11]、液相色谱法[12-14]、高效液相色谱-质谱法[15-17]等。免疫法不满足多残留药物同时检测，易出现假阴性或假阳性以应。电化学分析法和薄层色谱法特异性差、灵敏度低、选择性不高、定性能力较差。液相色谱法灵敏度较低、选择性差。高效液相色谱-质谱法因具有高的灵敏度、特异性和抗干扰能力，已成为痕量药物分析的首选方法。陈林等[18]采用改良QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged and safe）技术作为前处理方法，建立了辣椒制品中14 种非法添加工业染料的液相色谱-串联质谱联用快速检测方法；路杨等[19]采用凝胶渗透色谱仪作为前处理设备，采用超高效液相色谱仪作为检测设备，建立辣椒油和火锅底料中的10 种工业染料的检测方法。同时，针对当前天然植物提取物中非食用色素检测技术缺失，缺乏相关检测标准，建立高通量超痕量的检测技术，对检测方法进行实验室内、间的验证实验，考察方法学指标，为食品安全监管和溯源提供技术依据。因此，对植物提取物中非食用色素的检测方法技术进行研究非常必要。另外，传统的前处理方法比较耗时费力，而QuEChERS法萃取具有“快速、简易、廉价、有效、稳定、安全”的特点[20-26]，该方法是Anastassiades等[27]于2002年首先在欧洲农药残留研讨会提出，并于2003年正式发表了一种用于水果、蔬菜、谷物等低脂产品中多农药残留分析的前处理方法。QuEChERS方法具有技术要求低、操作简单、无需使用大量有机溶剂、分析过程快速等优点。

本研究以辣椒红色素为研究对象，选用QuEChERS前处理法，分别对提取溶剂、脱水剂、吸附剂进行优化，建立QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱检测方法，并对前处理基质效应和建立的方法进行评价和验证。为辣椒制品的食品添加剂中非法添加工业染料的检测提供一种更加快速、简便的技术支持，解决高浓缩提取物基质干扰严重的难题，为食品中非食用物质溯源技术提供参考，为食品安全监管提供有力的技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

辣椒红色素样品 晨光生物科技集团股份有限公司；乙腈、甲醇、乙酸（均为色谱纯） 德国默克公司；乙酸乙酯、正己烷、乙醚（均为分析纯） 赛默飞世尔科技有限公司；氯化钠为分析纯；实验所用水均为超纯水（电阻率为18.2 MΩ·cm）；苏丹红I（100 μg/mL）、苏丹红II（100 μg/mL）、苏丹红III（100 μg/mL）、苏丹红IV（100 μg/mL）、罗丹明B（95.52%）、碱性橙II（99.6%）、碱性橙21（98%）、碱性橙22（99.9%）、碱性嫩黄（79.5%）标准物质 德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；C18、N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）吸附剂 中国Agela Technologies公司。

1.2 仪器与设备

LCQ超高效液相色谱-质谱联用仪（配有电喷雾离子源及Xcalibur1.2数据处理系统） 美国Finnigan公司；HP 1100高效液相色谱系统（配有可变波长紫外检测器和Rev.A.06.03色谱工作站） 美国惠普公司；CT18RT型高速台式离心机 上海天美公司；涡旋混合器 大龙兴创实验仪器有限公司；KQ-500E型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

分别准确称取10 mg罗丹明B、碱性橙II、碱性橙21、碱性橙22、碱性嫩黄标准品，用乙腈定容配制质量浓度为1 mg/mL的单标储备液，将苏丹红I、苏丹红II、苏丹红III、苏丹红IV贮存在棕色储存瓶中，4 ℃保存备用。使用时，取各单标储备液适量，用初始比例流动相（0.1%甲酸溶液-乙腈（95∶5，V/V）配制成不同质量浓度的混合标准溶液。

1.3.2 样品的前处理

称取辣椒红色素样品2.0 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入10 mL 50%的乙腈溶液涡旋混匀，加入3 g氯化钠进行盐析，加入300 mg C18吸附剂净化后，涡旋混合2 min，超声提取10 min，以5 000 r/min离心5 min，取上清液。再加入10 mL 50%的乙腈溶液重复提取一次，合并2 次上清液用50%的乙腈溶液定容至20 mL。取1 mL经0.22 μm微孔滤膜过滤后进样测定。

1.3.3 色谱条件

Waters XBridge BEH C18（100 mm×2.1 mm，2.5 μm）分析柱；流动相A为0.1%甲酸溶液，流动相B为乙腈。梯度洗脱程序：0.1～1 min，5% B；1～3.5 min，5%～98% B；3.5～10.0 min，98% B；10.0～10.5 min，98%～5% B。流速0.3 mL/min；进样量2 μL。

1.3.4 质谱条件

电喷雾离子源；正离子扫描；多以应监测（multiple reaction monitoring，MRM）；离子源温度500 ℃；离子源电压5 000 V；雾化气、气帘气、辅助气和碰撞气均为高纯氮气。MRM检测离子对、去簇电压及碰撞电压见表1。

表1 9 种非食用色素的质谱优化条件Table 1 Optimized mass spectrometric parameters for 9 inedible pigments

1.4 数据统计及图表绘制

数据统计和处理采用液相色谱-质谱联用仪的Xcalibur1.2数据处理系统，图表绘制采用Microsoft Office Excel 2007版。

2 结果与分析

2.1 提取条件的优化

考察常用的提取溶剂乙腈、甲醇、乙酸乙酯、正己烷、乙醚作为提取剂时其提取效果的对比实验。实验以样品中目标物的回收率作为提取效果的评价指标。辣椒红色素能很好溶于乙腈和甲醇中，但结果表明乙腈提取效果比甲醇好；而正己烷、乙醚和乙酸乙酯作为提取溶剂时，不仅提取液中杂质较多，且提取效果欠佳。所以采用乙腈作为提取溶剂。

图1 乙腈溶液体积分数对目标物回收率的影响Fig. 1 Effect of ratio between acetonitrile and water on recoveries of target compounds

由于辣椒红色素基质复杂，在乙腈中加入适量的水有利于对辣椒红色素样品中杂质的去除，实验选取体积分数10%、20%、50%、80%、100%的乙腈溶液作为提取溶剂，结果如图1所示。50%乙腈溶液提取时具有较好峰形，且9 种非食用色素的回收率均较高，提取效果最好。故选择50%乙腈溶液作为提取溶剂。

2.2 净化条件的优化

图2 吸附剂对目标物回收率的影响Fig. 2 Effect of sorbents on recoveries of target compounds

常用的吸附剂有PSA、球形ODS C18填料、NH2氨基填料等[20-28]。辣椒红色素中富含色素、油脂等成分，根据辣椒红色素的基质特点，本实验选取了PSA、C18以及PSA与C18两种吸附剂组合作为考察对象用于前处理，如图2所示。结果发现，PSA对非食用色素会有一定量的吸附作用，C18对辣椒红色素中油脂等杂质有较好的吸附效果，基质干扰小，且目标化合物的回收率更高。实验还对C18吸附剂的用量进行优化，如图3所示。结果表明，吸附剂的用量越多吸附效果越好，但过多的吸附剂可以吸附目标化合物使回收率降低，当吸附剂的用量在300 mg时具有较好的吸附效果。

图3 C18用量对目标物回收率的影响Fig. 3 Effect of C18 dosage on recoveries of target compounds

2.3 超高效液相色谱条件的优化

图4 9 种非食用色素的MRM色谱图Fig. 4 MRM chromatograms of 9 inedible pigments

9 种非食用色素中的4 种苏丹红具有相似的基团和结构，为了准确定量，需色谱峰间有一定分离度。实验考察甲醇、乙腈、5 mmol/L乙酸铵溶液、0.1%甲酸溶液作为流动相，采用梯度洗脱技术，在C18色谱柱上进行色谱分离，结果表明，甲醇作为流动相时，9 种非食用色素分离度低，峰形较差，质谱响应较低；当以乙腈-乙酸铵和乙腈-0.1%甲酸溶液为流动相时，目标物峰形较好，但乙腈-0.1%甲酸溶液体系灵敏度更高，分离效果更好，如图4所示。因此，选择0.1%甲酸溶液-乙腈作为流动相，采用1.3.3节的梯度洗脱程序。

2.4 质谱条件的确立

非食用色素在质谱的行为较为复杂，将质量浓度为100 ng/mL的苏丹红I、苏丹红II、苏丹红III、苏丹红IV、罗丹明B、碱性橙II、碱性橙21、碱性橙22、碱性嫩黄9 种标准溶液，针泵进样进入质谱系统，采用Q1全扫描和碎片离子扫描确定其母离子和子离子，在针泵进样过程中优化碎裂电压、碰撞电压等仪器参数。每种分析物要选择最强且稳定的离子作为定量离子，另一个则为定性离子。9 种非食用色素的质谱条件经优化后结果见表1。

2.5 方法学验证

2.5.1 特异性

采用多以应监测模式，提取偏差在±0.005‰范围内的精确m/z的色谱图进行定量，加之色谱保留时间，方法的特异性高，没有发现有干扰成分影响9 种目标物的测定。在空白样品和空白样品添加的色谱质谱图中未发现干扰峰，说明方法具有较好的选择性。

2.5.2 基质效应、线性关系、检出限和定量限

1.3.2 节前处理净化方法的基质效应进行评价，其结果见表2，其中碱性橙II的基质效应最强，为0.07，其余均在-0.17～0.06之间。虽然9 种非食用色素均有一定的基质效应影响，但并不影响测定的准确性。有文献研究基质效应在-0.20～0.20之间可以不考虑基质效应的影响[29-31]。

用空白样品处理液按照1.3.1节配成系列标准工作溶液，用分析物峰面积对被测组分的质量浓度绘制标准曲线。由表2可知，碱性橙II、碱性橙21、碱性橙22、碱性嫩黄在0.2～8 ng/mL范围内线性关系良好，苏丹红I、苏丹红II、苏丹红III、苏丹红IV、罗丹明B在2～40 ng/mL范围内线性关系良好，其线性相关系数R2高于0.995 0。

以3 倍和10 倍信噪比分别确定了方法的检出限和定量限，结果见表2。9 种分析物的定量限在0.6～5.0 ng/g之间。

表2 方法的线性、基质效应、检出限和定量限Table 2 Linearity, matrix effect, LODs and LOQs of the method

2.5.3 准确度和精密度

在3 个水平下做样品加标回收率实验，考察方法的准确度和精密度（表3），平均回收率结果在69.6%～92.5%之间，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）在2.8%～8.5%之间。说明方法具有较好的准确度和精密度。

表3 方法的回收率和精密度（n= 5）Table 3 Recoveries and precision of the method (n= 5)

2.6 辣椒红色素样品的测定结果

图5 含有非食用色素的辣椒红色素样品Fig. 5 Detection of inedible pigments present in real sample

用实验建立的方法检测20 种辣椒红色素样品，在其中1 个样品中含有微量的苏丹红染料（图5），但含量低于我国规定的最大残留量1.0 μg/kg。

3 结 论

通过优化和对比实验，探讨QuEChERS提取及净化等前处理条件，考察辣椒红色素样品的基质效应，优化色谱和质谱条件，研究方法的回收率、检出限和定量限等技术指标，实现了辣椒红色素样品中9 种非食用色素的同时检测。实验结果表明，方法的基质效应在-0.17～0.07之间，检出限在0.2～1.5 ng/g之间，定量限在0.6～5.0 ng/g之间，碱性橙II、碱性橙21、碱性橙22、碱性嫩黄在0.2～8 ng/mL范围内呈线性，苏丹红I、苏丹红II、苏丹红III、苏丹红IV、罗丹明B在2～40 ng/mL范围内呈线性，目标物线性相关系数（R2）均大于0.995 0，3 个样品加标水平的平均回收率在69.6%～92.5%之间，RSD在2.8%～8.5%之间（n=5）。该方法简单快捷、准确可靠，适合于市售辣椒红色素中非食用色素的快速检测。