改良QuEChERS技术结合超高效液相色谱-串联质谱法同时测定果蔬中高氯酸盐、氯酸盐和溴酸盐

2020-06-01盛华栋潘项捷张水锋刘敏芳施元旭王璐璐陆文琪

食品科学 2020年10期

盛华栋，潘项捷，张水锋，刘敏芳，施元旭，王璐璐，陆文琪

（浙江方圆检测集团股份有限公司，浙江杭州 310018）

高氯酸盐是一种环境持久污染物，理化性质稳定，易溶于水，能污染地下水，并出现在土壤和食物中[1-2]。高氯酸盐能竞争性抑制甲状腺对碘的摄入，导致甲状腺功能紊乱，影响人体正常的新陈代谢和生长发育[3]。近年来，食品中高氯酸盐的污染受到人们广泛关注，奶类[4]、茶叶[5-7]、饮用水[8-9]、水果[10]和蔬菜[11]等均检出不同浓度的高氯酸盐。氯酸盐是饮用水二氧化氯消毒产生的副产物，同样能影响人体的甲状腺系统和血液系统[12]。欧洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）检测发现冷冻食品中氯酸盐的含量较高，果蔬污染最严重[13]。溴酸盐是一种面粉改良剂，同时也普遍存在经臭氧消毒的饮用水中[14]。溴酸盐被证明对人体肾脏有害，被国际癌症研究机构认定为2B级致癌物[15]。GB/T 5749—2006《生活饮用水卫生标准》规定氯酸盐的限量为0.7 mg/L，溴酸盐的限量为0.01 mg/L。

目前食品中有关高氯酸盐、氯酸盐和溴酸盐的检测常见的方法主要有离子色谱（ion chromatography，IC）法[16-18]、电感耦合等离子质谱（inductively coupled plasmamass spectrometry，ICP-MS）法[19-20]、离子色谱-串联质谱（ion chromatography-tandem mass spectrometry，IC-MS/MS）法[21-22]和液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法[23-25]等。IC法受基质干扰影响较大，ICP-MS法易受复杂基质中阳离子或阴离子的干扰，质谱检测器容易被污染[26]。IC-MS/MS法灵敏度高，抗干扰能力强，但设备普及率不高，不利于方法的推广和应用。LC-MS/MS法灵敏度高，能够在较短时间内完成多种物质的分析，抗基质干扰能力强。本研究采用改良的QuEChERS前处理方法，建立同时测定果蔬中高氯酸盐、氯酸盐和溴酸盐的超高效液相色谱-串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）检测方法，该方法稳定、分析周期短，能同时测定3 种有害的无机阴离子，为果蔬中有害无机阴离子的检测提供有效的技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

溴酸盐标准溶液（1 000 mg/L）中国计量科学研究院；高氯酸盐标准溶液（1 000 mg/L）美国O2si公司；氯酸盐标准溶液（1 000 mg/L）美国Inorganic Ventures公司；N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、C18深圳逗点生物技术有限公司；石墨化碳黑（graphitizing of carbon black，GCB）（120-400MESH）德国CNW Technologies公司；实验用水均为符合GB/T 6682—2008《分析实验室用水国家标准》的实验室一级用水；乙腈（色谱纯）德国Merck公司。

1.2 仪器与设备

Triple Quad 5500三重四极杆串联质谱仪（配有电喷雾离子源）美国AB SCIEX公司；Milli-Q超纯水仪美国Millipore公司；ST16R高速冷冻离心机美国Thermos公司；HY-2A调速振荡器江苏金坛荣华有限公司；VG3 S025涡旋混合器、T25高速匀浆机德国IKA公司；GM200刀式研磨仪德国Retsch公司。

1.3 方法

1.3.1 样品的制备和处理

新鲜的果蔬取其可食部分，用研磨仪制成匀浆备用。称取处理好的样品5 g（精确至0.01 g）至50 mL离心管中，加10 mL 50%乙腈溶液，涡旋1 min，超声提取8 min，8 000 r/min离心5 min，转移上清液于25 mL容量瓶中，重复提取一次，合并上清液于25 mL容量瓶中，用乙腈定容至25 mL，摇匀，待净化。取1.0 mL提取液于2.5 mL预先加有净化剂（PSA、C18和GCB）的离心管中，涡旋1 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液，过0.22 μm滤膜，上机测定。

1.3.2 标准溶液的配制

混合标准储备液（1.0 mg/L）的配制：准确移取1 000 mg/L的高氯酸盐、氯酸盐和溴酸盐标准溶液100 μL于100 mL容量瓶，超纯水定容，4 ℃保存，保质期1 周。

空白基质提取液：样品按照1.3.1节条件进行前处理后进行仪器分析，当3 种阴离子的定性与定量离子信噪比均小于3 时，样品确定为空白基质。空白基质按照1.3.1节条件进行前处理，获得空白基质提取液。

基质混合标准溶液的配制：采用逐级稀释的方式将标准储备液配制成0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的系列基质混合标准工作溶液。

1.3.3 UPLC-MS/MS条件

UPLC条件：色谱柱IC-PakTMAnion HR（4.6 mm×75 mm，6 μm），柱温：40 ℃，进样量：5 μL。流动相A为乙腈，B为80 mmol/L乙酸铵；等度洗脱程序：0～7 min，A 60%+B 40%；流速：0.7 mL/min。

质谱条件：电喷雾离子源，负离子模式；离子源温度450 ℃；雾化气压力60 psi；辅助气压力60 psi；气帘气压力35 psi；扫描模式：多以应监测（multi reaction monitor，MRM）。

2 结果与分析

2.1 仪器条件优化

2.1.1 质谱条件优化

在3 种离子中都存在卤族元素（Cl和Br），属于强吸电子基团，使得分子中的氢质子极易失去形成负离子。分别配制100 μg/L的3 种阴离子标准溶液，使用针泵进样模式，在电喷雾离子源，负离子模式下进行Q1全扫描，能获得3 种离子稳定的分子离子峰[M-H]-。选择溴酸盐母离子（m/z126.9）、高氯酸盐母离子（m/z99.0）、氯酸盐母离子（m/z83.0），对每个母离子分别进行二级碎片扫描，发现3 种离子都可以失去一个或两个氧原子以形成相应的片段，选取2 个响应较高的碎片作为子离子，建立MRM离子对，分别优化质谱参数，3 种离子的具体参数见表1。

表1 高氯酸盐、氯酸盐和溴酸盐的质谱参数Table 1 Mass spectrometric parameters for detection of bromate,perchlorate and chlorate

2.1.2 色谱条件的优化

比较Waters ACQUITY UPLC BEH C18和Agilent ZORBAX SB-Aq柱发现3 种离子出峰较快，保留时间为1.2 min左右，说明3 种离子在这两种柱子中保留效果较差。实际样品检测时无法有效分离干扰峰。本方法使用IC-PakTMAnion HR色谱柱，为阴离子交换柱，适合分析强阴离子[27]。流动相选择乙腈-乙酸铵溶液体系，实验比较不同浓度的乙酸铵对3 种离子出峰时间和峰形的影响，乙酸铵浓度为5 mmol/L和20 mmol/L时，3 种离子无法洗脱；当乙酸铵浓度增加到50 mmol/L时，出峰时间较晚，峰形较宽；当乙酸铵浓度增加到80 mmol/L时，峰形较好、灵敏度较高，总离子流图如图1所示。最终选用80 mmol/L乙酸铵和乙腈作为流动相，流速为0.7 mL/min，7 min内可完成分析，高氯酸盐出峰时间为5.4 min，氯酸盐出峰时间为4.6 min，溴酸盐出峰时间为4.1 min。提取离子色谱图如图2所示。

图1 使用50 mmol/L（A）和80 mmol/L（B）乙酸铵时总离子流图Fig. 1 Total ion chromatograms at ammonium acetate concentrations of 50 (A) and 80 mmol/L (B) in mobile phase

图2 高氯酸盐（A）、氯酸盐（B）和溴酸盐（C）的提取离子色谱图Fig. 2 Extracted ion chromatograms of perchlorate (A), chlorate (B)and bromate (C)

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 提取剂的优化

QuEChERS法常用的提取溶剂是乙腈，乙腈极性范围宽，组织穿透能力强，对脂肪、糖和蛋白质类化合物提取率低[28]，同时3 种无机阴离子都有较好的水溶性。如图3A所示，实验以乙腈和水作为提取剂，以添加量为50 μg/kg的青菜基质为例，比较25%、50%、75%乙腈溶液以及纯乙腈、纯水的提取效果。结果表明，乙腈比例超过50%时3 种离子的相对强度都较高。实验结果表明纯水提取时，提取液颜色较浅，说明胞内组织液并没有提取充分。综合考虑选择50%乙腈溶液作为提取溶剂，为保证提取效果，重复提取2 次。

图3 提取剂中乙腈体积分数（A）和超声提取时间（B）对3 种阴离子提取效率的影响Fig. 3 Effects of acetonitrile concentration (A) and ultrasonic extraction time (B) on extraction efficiency of three anions

2.2.2 提取时间的优化

采用超声辅助提取法，超声波独有的物理特性，能促使植物组织破壁。实验考察超声提取5、8、10、15 min和20 min对提取效率的影响。结果表明，超声8 min以后，3 种离子的相对强度都较高，因此超声提取时间选择8 min，结果见图3B。

2.2.3 净化材料的优化

QuEChERS法常见的净化吸附剂有PSA、GCB和C18。PSA作为弱阴离子交换吸附剂，能去除非极性样品中的极性杂质，如糖类、有机酸和色素等。GCB作为弱极性或非极性吸附剂，能有效去除色素、类胡萝卜素和甾醇等非极性化合物[29]；C18可以吸附脂质和脂类等非极性杂质[30]。实验考察3 种吸附剂的净化效果，以添加量为50 μg/kg的青菜基质为例，取1.0 mL按照1.3.1节方法处理后的提取液，分别加入PSA（50、100、150、200 mg）、GCB（20、30、40、50 mg）和C18（50、100、150、200 mg），计算回收率[31]。结果表明单一使用PSA时3 种离子的回收率较低，只有50.0%～65.0%，说明PSA在净化样品的同时对3 种阴离子都具有吸附作用，因此放弃使用。单一使用GCB用量从20 mg增加至50 mg时，3 种离子的回收率能显著增加，当GCB用量40 mg时3 种离子的回收率都能达到90%以上。单一使用C183 种离子的回收率也较高，当C18用量从50 mg增加至200 mg时，回收率在75%～92%之间，回收率提升不明显。考虑到果蔬基质主要以脂类和色素为主，而GCB去除色素的效果较好，因此选择GCB和C18联合使用作为净化吸附剂，当GCB 40 mg和C18200 mg组合使用时3 种离子的回收率达到92%以上，满足分析要求，结果如图4所示。

图4 净化材料及使用量对3 种阴离子回收率的影响Fig. 4 Effect of the amount of purification materials on recoveries of three anions

2.3 方法学评价

2.3.1 基质效应

表2 基质匹配标准曲线和溶剂标准曲线的比较Table 2 Comparison between matrix-matched calibration and solvent calibration

基质效应是指样品中除目标物以外的组分，对待测分析物测定值的影响，包括基质增强效应和基质减弱效应。在UPLC-MS/MS分析中，需对基质效应进行评价，并采取措施，保证结果的准确可靠。常见的降低基质效应的方法有基质匹配标准溶液法、同位素内标法和减小进样量等[32]。本研究采用标准曲线斜率比较法[33]考察3 种阴离子在常见3 种蔬菜水果中的基质效应，结果见表2。由表2可知，3 种离子都存在不同程度的基质效应，因此本研究采用配制基质匹配的标准曲线降低基质效应。

2.3.2 线性范围和检出限

在优化的分析条件下，配制3 种离子的基质混合标准溶液，经UPLC-MS/MS测定后，以定量离子峰面积（y）为纵坐标，基质标准溶液浓度（x）为横坐标，绘制标准曲线。3 种离子在3 种基质中的线性方程、线性相关系数、检出限（RSN=3）和定量限（RSN=10）见表2。3 种离子在0.5～100 μg/L范围内线性关系良好，线性相关系数均大于0.999，高氯酸盐的检出限为1.5 μg/kg，定量限为5.0 μg/kg；氯酸盐的检出限为1.0 μg/kg，定量限为3.0 μg/kg；溴酸盐的检出限为0.5 μg/kg，定量限为2.0 μg/kg。

2.3.3 回收率和精密度

称取苹果、梨和青菜3 种基质空白样品，添加5.0、20.0 μg/kg和50.0 μg/kg的混合离子标准溶液，按优化好的实验方法进行前处理，计算回收率和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果如表3所示。结果表明：3 种离子在3 种基质中的平均回收率为80.3%～110.1%，RSD在2.1%～9.6%之间，满足日常检测需求。

表3 典型样品中3 种离子的加标回收率和相对标准偏差（n=6）Table 3 Recoveries and RSDs of perchlorate, chlorate and bromate from spiked typical samples (n= 6)

2.3.4 实际样品的检测结果

采用本研究的方法对浙江杭州地区市场上抽检的100 批次果蔬进行测定。结果显示：氯酸盐检出6 批次，主要包括生姜和青菜等，检出范围为15～75 μg/kg。高氯酸盐检出21 批次，主要包括韭菜、苹果和橘子等，检出范围为30～800 μg/kg。实际样品检测表明，果蔬中有害阴离子污染发生率较高。阳性样品提取离子色谱图如图5所示。