碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的分布及耐药性分析*

宋 静，戎建荣

(1.山西医科大学，山西太原 030051；2.山西大医院检验科，山西太原 030032)

肺炎克雷伯菌是一种常见的肠杆菌科细菌，可引起医院感染，是一种条件性病原体。当身体的免疫功能下降时，细菌会在肺部、泌尿道等许多部位引起感染[1]。碳青霉烯类抗菌药物作为临床治疗肠杆菌科细菌引起感染的重要药物，近年来，随着这些药物的广泛使用，碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(CRKP)已经出现在世界各地，检出量逐年上升，引起医疗界的广泛关注[2]。

本研究以山西大医院临床分离的CRKP菌株为研究对象，探讨其临床分布及耐药性。为临床针对不同酶型用药，控制产酶菌株提供理论依据。同时，采用2017年美国临床和实验室标准协会推荐的改良碳青霉烯类灭活实验(mCIM)对碳青霉烯酶进行筛选[3]，并探讨其在检测CRKP中的应用价值。

1 材料与方法

1.1菌株来源 收集2018年1月至2019年1月山西大医院微生物实验室检出的41株CRKP，排除同一患者重复分离的菌株。质量控制菌株ATCC 25922、ATCC 1705、ATCC 1706。

1.2方法

1.2.1菌株鉴定及药敏试验 使用法国VITEK-2自动微生物分析仪进行鉴定及药敏实验，参照美国临床和实验室标准协会最新参考标准判断折点；纸片扩散法用于药敏试验结果的补充。

1.2.2mCIM 根据美国临床和实验室标准协会M100-S27文件推荐方法[3]，取过夜培养纯菌落1 μL接种环满环，置于2 mL TSB培养基中，并充分摇动。将10 μg美罗培南纸片浸入细菌悬浮液中，并在大气条件下于(35±2)℃温育(4±0.25)h。在温育快要结束时，制备大肠杆菌ATCC 25922悬浮液(0.5麦氏浊度)并在M-H琼脂平板上均匀涂布。将过量药敏纸片上的细菌溶液挤出并用无菌镊子贴在上述M-H琼脂平板上，在35 ℃下孵育18～24 h以测量抑菌圈的直径。

1.2.3基因检测 加热煮沸法制备DNA模板，PCR扩增KPC、GES、IMP-1、GIM[4]、NDM、VIM、SPM、OXA-48[5]基因序列。放置在1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，观察UV灯下的PCR产物。见表1。

表1 耐药基因引物序列

1.2.4DNA测序 PCR产物由北京赛默飞公司完成测序，根据所测序列与GenBank中BLAST程序中的序列比对。

1.3统计学处理 采用SPSS17.0统计学软件进行统计学分析，计数资料采用百分比表示。

2 结 果

2.1标本来源 分离出41株CPKP菌株，其中13株来源于痰标本，占31.71%，见表2。

表2 41株CPKP菌株的来源和比例

2.2科室分布 重症医学科构成比较高，占24.39%，其次为普通外科，占21.95%。不同科室CRKP的分布，见表3。

表3 CPKP菌株的分布及比例

2.3CPKP菌株的药敏分析 41株CRKP分离株对常用药物的耐药性均在90%以上。对氨基糖苷类药物庆大霉素、头孢菌素类(3代、4代)抗菌药物，青霉素或3代头孢菌素和酶抑制剂(阿莫西林/棒酸、哌拉西林/他唑巴坦)的组合显示出更高的耐药率，替加环素显示出较低的耐药率，见表4。

表4 CPKP菌株的药敏分析

续表4 CPKP菌株的药敏分析

2.4表型实验与分子学方法比较 应用统计软件SPSS17.0与PCR检测方法行一致性检验，Kappa=0.48，一致性程度尚可，灵敏度95%、特异度100%。

2.5基因检测 41株产碳青霉烯酶菌株进行测序，40株携带KPC基因。其中，1株菌同时携带KPC和NDM基因，1株携带NDM基因，剩余耐药基因为阴性。

3 讨 论

本研究显示，分离的CRKP主要来源于重症医学科(24.39%)和普通外科(21.95%)，标本类型主要为痰(31.71%)、尿液(19.51%)和血液(19.51%)，可能与该科室中患者存在基础疾病重、住院时间长，抗菌药物使用不规范、常进行侵入性诊疗等有关[6-7]。因此，对于此类科室，应该严格落实医院感染控制相关措施，积极隔离CRKP感染的患者，尽可能阻断交叉传播途径，以降低CRKP的感染率。

CRKP治疗临床感染的主要原因是碳青霉烯酶的产生[8-10]。根据分子结构，可以分为A类、B类和D类。A类，最常见的是KPC型，是丝氨酸酶；B类以NDM、VIM及IMP型更常见，发挥活性需要金属离子参与；D类碳青霉烯酶为OXA-23，OXA-48型等。在本研究中，mCIM测定法用于检测耐药菌株是否产生碳青霉烯酶，检测灵敏度95%，特异度100%，灵敏度低的原因可能为同时合并产AmpC酶、外排泵的高表达等其他耐药机制[11]。KPC型为主要的酶类型，且这类菌株往往表现出高水平耐药，可选择药物较少，因此一旦出现这类细菌，临床将会面对一个非常棘手的问题。此外，编码KPC型酶的编码基因常常通过质粒介导，因此很容易在不同种属细菌之间进行转移和传播[12]。同时，还有1株菌株同时携带KPC和NDM基因，1株菌株携带NDM型，这类菌株对多黏菌素和替加环素以外的抗菌药物具有泛耐药特性[13]，也应该引起临床足够的重视。

总之，本院CRKP的耐药率超过90%，主要集中在重症监护病房。KPC型的碳青霉烯酶的产生是CRKP耐药的主要原因，需引起医务人员的关注。mCIM作为筛选碳青霉烯酶表型方法，可以准确、及时地用于产酶菌株的筛选，为临床医生进行个体化治疗提供依据，同时协助医院感控部门控制CRKP的传播及暴发。