亚麻木酚素促进绝经期妇女种植体骨结合机制

张云涛 马向瑞 王松松 刘菲

(滨州医学院附属医院口腔科，山东 滨州 256600)

种植修复已成为当今的主流修复方式，其中骨质疏松的问题给种植手术及预后带来了极大的挑战。绝经后的女性由于雌激素的降低，骨质疏松的发生率较高〔1〕，从而影响种植修复中的骨结合。研究表明，亚麻木酚素(SDG)能提高患者体内血清钙含量并增加甲状腺旁腺激素与骨的敏感性〔2〕，促进体内新骨的形成，减少骨质的流失〔3〕。因此，通过本实验观察SDG对成骨细胞的增殖分化及护骨素(OPG) mRNA表达的影响。

1 材料和方法

1.1主要器材和材料 激光扫描共聚焦显微镜(TCS SPE，Leica，德国)；紫外-可见光分光光度计( Eppendorf，德国)；CO2细胞培养箱(Thermo Fisher Scientific，美国)；酶标仪(Thermo lab systems multiskan mk3，美国)；荧光实时定量-聚合酶链反应(PCR)仪(Rotor-Gene 3000，Corbett，澳大利亚)；α-MEM 培养液(Hyclone)；噻唑蓝(Sigma，美国 )；SDG(美仑生物meilunbio®)；碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒(碧云天)；反转录试剂盒(PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser)；总RNA 提取试剂(RNAiso Plus)；PCR试剂盒(Takara，日本)；Rhodamine Phalloidin(Cytoskeleton，美国)。

1.2MC3T3-E1细胞培养 由华西口腔医学院赠送。用含 10%胚牛血清(FBS)，青霉素 100 U/ml，链霉素100 μg/ml的α-MEM培养液，置于37℃、5% CO2的环境中培养，取3 次传代后处于对数生长期的细胞进行实验。

1.3不同浓度梯度SDG培养液的配制 配制含SDG培养液：0、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L，共6个浓度组。

1.4噻唑蓝(MTT)法检测成骨细胞增殖 将MC3T3-E1细胞接种于96孔板，密度为5×104个/ml，每孔加200 μl细胞悬液，设3个复孔；细胞培养箱中培养24 h后，更换为含SDG浓度为0、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L的培养液；培养1 d、2 d、3 d时，每孔加入浓度为5 mg/ml MTT 20 μl及无血清培养基100 μl，要求在避光环境下进行。5%CO2、37℃培养箱中孵育4 h，吸去孔内培养液，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，置摇床上低速振荡10 min，取下96孔板在酶标仪490 nm波长处测量各孔的吸光值(A值)，同时设置调零孔。

1.5ALP活性检测 以 3×104个细胞/ml的密度接种于6孔板，毎孔1 ml细胞悬液，每组设3复孔，培养箱中培养24 h，更换为含SDG浓度为0、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L的培养液，培养3、7、14 d，每孔加入细胞裂解液200 μl，裂解后离心机离心取上清液，参照ALP试剂盒说明书操作剩余步骤，设定酶标仪405 nm波长处测定其A值。

1.6RT-qPCR 检测细胞OPG mRNA 的表达 将对数生长期的MC3T3细胞计数为3×104/ml的混悬液接种在6孔板，每孔添加2 ml，设置3个复孔，24 h细胞充分贴壁后，更换为含SDG浓度为0、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L的培养基，细胞培养3 d后提取，分光光度计检测总RNA纯度，结果显示各组 A260/A280值均在1.7～2.1之间，参照说明书合成 cDNA。内参GADPH及OPG 引物的合成见表1，RT-qPCR 反应采用荧光染料法(参照宝生物染料法荧光定量试剂盒SYBR Premix Ex Taq 说明)，反应条件为95℃预变性30 s，1个循环；95℃变性5 s，60℃退火30 s，45个循环。选择20 μl体系：SYBRⅡ 10 μl，上游引物下游引物各0.8 μl，RT反应液1.6 μl，焦碳酸二乙酯(DEPC)水，6.8 μl。收集荧光信号进行分析，使用荧光阈值表示RT-qPCR 结果，定义对照组基因表达量为1，根据公式(2-ΔΔCt)计算目的基因表达量，获得每组基因的相对表达量。

表1 RT-qPCR 引物序列

1.7细胞骨架染色 24孔板中接种处于对数生长期的细胞，并制作细胞爬片，每孔置密度为5×104个/ml的细胞悬液1 ml，细胞贴壁后，更换为含SDG浓度为0、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L的培养液，设置3复孔，孵育24 h后，去除原培养液后磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，再次清洗3次，每次10 min。200 μl浓度为100 nmol/L的Rhodamine Phalloidin覆盖爬片，避光环境下室温孵育30 min后充分冲洗3次，每次5 min，抗荧光淬灭封片，置于激光共聚焦显微镜下进行观察爬片。

1.8统计学分析 采用SPSS21.0 软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1MTT法检测成骨细胞增殖情况 与空白组比较，10-5mol/L组细胞在1、2 d时增殖受到抑制，差异有统计学意义(P<0.05)，3 d时差异无统计学意义(P>0.05)；10-6mol/L与10-9mol/L组均无统计学意义(P>0.05)；10-7mol/L组、10-8mol/L组显著增加(P<0.05)，见表2。

表2 不同浓度SDG对MC3T3增殖的影响

与空白组对比:1)P<0.05;下表同

2.2ALP活性测定 与空白组比较，10-7、10-8mol/L组ALP活性显著增高(P<0.05)，其中10-7mol/L组ALP最高；10-5mol/L组ALP活性显著降低(P<0.05)，10-6、10-9mol/L两组ALP活性无明显变化(P>0.05)，见表3。

表3 不同浓度SDG对ALP的影响

2.3OPG mRNA表达情况 与空白组(1.00±0.04)比较：10-5mol/L组OPG表达水平(0.75±0.04)显著下调(P>0.05)，10-6、10-7mol/L组OPG mRNA表达水平(1.50±0.10，2.25±0.12)显著上升(P<0.05)，10-8、10-9mol/L组DPG mRNA表达水平(1.25±0.18、1.22±0.03)差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4细胞骨架形态的染色 10-5mol/L组细胞伸展面积较小，内部结构层叠不清晰，肌动蛋白纤维不甚清晰，10-9～10-6mol/L组，随着浓度的升高，细胞伸展面积增大，细胞骨架的内部结构更为清晰。其中10-7、10-6mol/L两组中可清晰看见纤维走行及细胞内部结构。见图1。

图1 不同浓度SDG作用24 h对MC3T3-E1细胞骨架形态的影响(激光扫描共聚焦显微镜，× 400)

3 讨 论

有资料表明，60 岁以上中老年绝经后女性成为骨质疏松的高危人群，其发病率约为67.80%，而老年女性则高达82.30%〔4〕，由于此类群体处于绝经期，体内雌性激素分泌降低，最终导致骨的流失。目前临床上常用雌激素类药物治疗及预防骨质疏松，然而此类药物存在明显的副作用，而且长期使用会增加子宫内膜癌和乳腺癌的发生风险〔5〕。植物雌激素是一类来源于植物的化合物，常以糖苷的形式存在植物中，在结构和功能上与甾体类激素相似，具有弱雌激素活性作用〔6，7〕。SDG与雌激素结构十分相似，相关研究认为其对雌激素依赖性疾病骨质疏松有预治作用〔8，9〕。因此用毒副作用小的天然植物替代雌激素药物，对于治疗骨质疏松成为新的疗法。

本实验结果说明SDG低浓度时能增进成骨细胞的活性，在高浓度时抑制其活性，与李高舜等〔10〕通过实验所得结论基本一致。

新的骨质形成及钙化的发生需要ALP的存在〔11〕。ALP活性代表了细胞分化的能力，ALP活性越高成骨细胞的分化能力越强。本研究中SDG培养液可以促进成骨细胞ALP的表达活性，说明低浓度时能增进成骨细胞的活性，与李高舜等〔10〕的实验结果基本一致。

研究表明，OPG起到了防止骨质吸收发生的作用〔12〕。成骨细胞中存在着大量OPG，随着成熟细胞分化成熟而相应的增加。因此OPG的表达可以反映成骨能力。本研究表明，中低浓度SDG能够促进护骨素基因水平的表达，对成骨细胞的增殖有促进作用，高浓度时抑制其基因水平的表达〔13〕。

高浓度SDG可明显地抑制成骨细胞增殖、成骨相关基因的表达及细胞伸展黏附，SDG浓度为10-7、10-6mol/L可促进细胞增殖、成骨相关基因的表达及细胞伸展黏附，提示合适浓度的SDG可能促进种植体的骨结合，提高种植成功率。