苦瓜皂甙的提取及其对胰脂肪酶抑制活性的研究

周巧杰，吴子健，*，胡佩卿，侯惠静

（1.天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津300134；2.广东宝莱特医用科技股份有限公司，天津300134；3.天津天狮学院 食品工程学院，天津301700）

目前常用的减肥药是通过影响中枢神经系统来抑制人体的食欲，但会对神经系统造成伤害[1-3]，而植物源的皂甙、多酚以及三萜类化合物会通过降低甚至是抑制脂肪酶的活力[4-5]，使得脂肪在进入机体后无法得到有效的分解，脂肪在胃肠道内无法得到吸收，是目前比较有效的一种减肥的手段[6-8]，诸如：2006年Kimura H等发现七叶树种子皂苷混合物可强烈抑制胰脂肪酶的活性[9]；2008年Hu J等的研究进一步证明七叶树种子的总皂甙混合物能有效降低机体对于脂肪的吸收，从而抑制喂食高脂肪食物小鼠的体重、机体脂肪含量以及肝脏脂肪含量的增加[10-11]；Zheng Q等发现从丝石竹根部提取出的皂甙混合物能有效抑制了胰脂肪酶活性，丝石竹根部皂甙混合物对于脂肪酶IC50值为0.54 mg/mL[12]；Karu N等发现源自人参根的人参皂甙能有效控制高脂饮食条件下，进食小鼠的体重，小鼠机体血浆中的三酰甘油量低于预期值，其对于胰脂肪酶的 IC50值为 500 μg/mL[13]。

苦瓜（Momordica charantia）是一种药食同源的葫芦科植物食材，性苦味寒，是中国家庭常用蔬菜之一。其含有丰富的皂甙类物质，主要由皂甙元和糖、糖醛酸组成，苦瓜皂甙（Momordica saponins）不仅具有降血糖、抗氧化、提高免疫能力、降低胆固醇、抗艾滋病毒等生理功能，也具有较强的抑制脂肪酶酶活性的作用[14-15]，其可能会成为减肥的辅助食物补充剂。本研究目的是优化乙醇溶剂法提取苦瓜皂甙的工艺条件，并对苦瓜皂甙对胰脂肪酶的抑制性做出相应分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苦瓜粉：朝阳大地农产品加工有限公司；猪源胰脂肪酶、人参皂苷Rg1标准品：Sigma公司；橄榄油：中国粮油食品进出口有限公司。其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

3-18K台式高速冷冻离心机：德国SIGMA公司；R-200旋转蒸发仪：日本EYELA公司；NTS-4000C型恒温振荡水槽：东京理化器械株式会社；FW80微型高速万能粉碎机：天津市华鑫仪器厂；ZHWY-2102C新型恒温震荡器：上海智成分析仪器制造有限公司；AL204型电子天平、UV5紫外可见分光光度计：梅特勒－托利多仪器上海有限公司；FDU-810型冷冻干燥机：日本东京理化。

1.3 方法

1.3.1 苦瓜皂甙提取的基本工艺路线

苦瓜粉→正己烷脱脂→乙醇浸提（合并浸提液）→离心→过滤→得皂甙粗液→旋转蒸发得浓缩液→测定浓度→真空冷冻干燥→皂甙粉→测定胰脂肪酶活力抑制率[16-17]

1.3.2 苦瓜粉脱脂处理

苦瓜粉脱脂采用正己烷脱脂法[18]，具体步骤如下：干燥的苦瓜粉碎过24目筛，收集粉末；取20 g筛分的粉末，按苦瓜粉 ∶正己烷=1.0∶2.5（g/mL）混匀，并于4℃下磁力搅拌30 min进行脱脂；然后4℃下离心（4 000 g）10 min，弃上清，并重复上述3次操作，最后沉淀物（即脱脂后的苦瓜粉）干燥备用。

1.3.3 响应面法优化苦瓜皂甙提取条件

为确定苦瓜皂甙的提取最佳提取条件，以提取物产量为响应值，采用三步法进行优化。第一步采用五因素二水平部分因子试验设计，挑选出显著影响因素；第二歩通过最陡爬坡试验确定响应值最大时的中心试验点；第三步利用响应曲面法中的中心复合设计进行试验，通过试验数据拟合得到二阶响应面模型，最终确定最优的苦瓜皂甙提取条件，并进行验证。响应面试验设计因素与水平表见表1。

表1 响应面试验设计因素与水平表Table 1 Response surface test design factors and level table

1.3.4 苦瓜皂甙提取产率的测定与计算

苦瓜皂甙含量的测定利用分光光度法[19]进行：以人参皂苷Rg1作为标准物质，在550 nm处测定吸光度，最后依据回归方程，计算样品中苦瓜皂甙的含量。苦瓜皂甙的提取产率按下式计算：

式中：m1为样品溶液中苦瓜皂甙的质量，mg；m2为脱脂苦瓜干粉的质量，mg。

1.3.5 胰脂肪酶抑制率的测定

在50 mL的三角烧瓶中加入15 mL反应介质（150 mmol/L NaCl2、2 mmol/L Tris、10 mmol/L CaCl2，0.08 mg/L猪胆盐）和0.5 g底物乳液（4%聚乙烯醇与三丁酸甘油酯以3∶1混合，高速搅拌均匀，得乳白色）[20]，机械搅拌5 min后加入一定量的猪胰脂肪酶混匀，反应3 min后，加入15 mL 95%的乙醇灭活胰脂肪酶。在反应完的体系中加入酚红－麝香草酚蓝指示剂1滴～2滴，用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定，使反应液的pH值恒定在7.5，记录消耗NaOH滴定液的体积A（mL）。空白试验在加入15 mL乙醇之后再加入脂肪酶，记录消耗NaOH滴定液的体积B（mL）。按下式计算脂肪酶活力：

式中：A为平行试验组消耗氢氧化钠滴定液的平均体积，mL；B为空白试验消耗氢氧化钠滴定液的体积，mL；M为氢氧化钠滴定液的摩尔浓度，mol/L；W为脂肪酶的取样量，g；T为反应时间，min；

胰脂肪酶活力单位定义：在37℃，pH值为7.5的条件下，脂肪酶每分钟水解三丁酸甘油脂生成1 μmoL脂肪酸所需的酶量，为1活力单位。

对于胰脂肪酶的抑制率的计算按照公式（3）进行计算。

1.3.6 苦瓜皂甙对胰脂肪酶抑制率的测定

将苦瓜皂甙浸提物配制成浓度分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mg/mL 不同溶液，参考 1.3.5胰脂肪酶抑制率的测定方法，测定各种浓度苦瓜粉浸提物对胰脂肪酶活性的抑制率。

2 结果与分析

2.1 部分因子试验结果及回归分析

部分因子试验结果见表2。

表2 部分因子试验结果Table 2 Experimental results of some factors

部分因子试验结果回归分析见表3。

表3部分因子试验结果的回归表明：温度、时间和料液比3个预测变量P值均小于0.05，因此它们是苦瓜皂甙提取过程中显著性影响因子。

2.2 中心试验点的确定结果

在确定了苦瓜皂甙浸提过程中显著性影响因子后，针对浸提温度、时间和料液比进行最陡爬坡试验，显著因素的方向、步长和试验结果如表4所示。

表3 部分因子试验结果回归分析Table 3 Regression analysis of partial factor experimental results

表4 最陡爬坡试验及结果Table 4 Experiment and results of the steepest climb

从表4中可以看出在温度为40℃、时间为75 min、料液比1∶13（g/mL）时苦瓜皂甙的产率达到最大值，确定该组合为响应面试验设计的中心点。

2.3 最佳浸提条件的确定结果

2.3.1 响应面试验设计及结果

选取浸提次数在较低水平，即1次，乙醇浓度在较高水平，即50%，进行三因素三水平中心组合试验。试验的设计及响应结果如表5所示。

表5 中心复合试验结果Table 5 Results of central composite experiment

续表5 中心复合试验结果Continue table 5 Results of central composite experiment

用Design Expert 8.0.6响应面分析软件进行多元回归分析，对各因素进行回归拟合，得到二次回归方程式：

Y=-17.17030+0.099881X4+0.087809X3+1.97715X5-0.000 1X3X4-0.004 595X4X5+0.003 959X3X5-0.000 395 9 X4X4-0.000 945 9X3X3-0.080 13X5X5

决定系数R2=0.926 4，说明回归方程拟合较好。

。按照实际需求，D大多处于30～60 s范围内；而发车间隔H在高峰段约为120～300 s，在低峰段约为180～600 s。由此可确定基因的长度，并相应随机选择50个个体组成种群。

2.3.2 回归分析模型及方差分析

回归分析模型及方差分析结果见表6。

表6 回归分析模型及方差分析结果Table 6 Box-behken experiment and results

从表6中可以看到，回归模型的显著性检验P＜0.05，表明该模型具有统计学意义。此外失拟项P值为0.113 8＞0.05不显著，进一步说明模型拟合程度较好，用上述回归方程可很好地描述各因子与响应值之间的关系，因此可用该回归方程对苦瓜皂甙的提取产率进行预测和分析。同时其自变量一次项X3，X5，二次项X32，X42，X52，交互项 X3X5，X4X5均显著（P＜0.05），说明它们对苦瓜皂甙的提取产率有显著影响。

2.3.3 响应面分析与最优条件确定

响应面分析方法中的等高线图可以直观反映两因素交互作用的显著程度，椭圆形表明两因子相互作用显著，而圆形恰好相反，表明不显著[21-22]。各因素交互作用对皂苷提取率的曲面图和等高线图见图1。

图1 各因素交互作用对皂苷提取率的曲面图和等高线图Fig.1 Curve diagram and contour diagram of extraction rate of saponin by interaction of various factors

由图1 a的曲面图可以看出当温度不变时，苦瓜皂甙的提取产率随着时间的增大呈现降低的趋势，而当时间不变时，苦瓜皂甙的提取产率对温度差异不敏感，没有明显变化。由等高线可知，提取时间比温度对皂甙提取产率影响大，与方差分析一致。当温度在33℃～48℃，时间在72 min～80 min时，有利于苦瓜皂甙的提取。

由图1 b可以看出当温度和料液比分别不变时，伴随着温度和料液比的增大，苦瓜皂甙的提取率呈现下降的趋势。由等高线可知，与温度相比，苦瓜皂甙的提取率受料液比的影响较大，与方差分析一致。当温度在33℃～47℃，料液比在1∶12.8（g/mL）～1∶13.75（g/mL）时，有利于苦瓜皂甙的提取。

采用Design Expert 8.0.6软件对回归方程进行分析，得到提取苦瓜皂甙的最佳工艺条件为：乙醇浓度为50%，料液比为 1∶13.5（g/mL），浸提温度为38.34℃，浸提时间为77.11 min，浸提次数为1次时，提取产率为1.428 4%。

2.4 最佳浸提条件试验结果

利用上述响应面法试验得到的苦瓜皂甙的提取条件，进行3次提取试验（平行试验），结果见表7。

表7 验证与比较试验结果Table 7 Verification and comparison of experimental results

由表7结果可知，最终皂甙产率达1.419 1%，与数学模型预测的最大产率符合，说明50%乙醇、料液比 1∶13.5（g/mL），温度 38℃，浸提 77min，浸提 1次是苦瓜皂甙提取的最优条件。

2.5 不同浓度的苦瓜皂甙对胰脂肪酶抑制率的分析结果

苦瓜皂甙浓度对其脂肪酶抑制率的影响见图2。

图2 苦瓜皂甙浓度对其脂肪酶抑制率的影响Fig.2 Effect of concentration of Momordica saponins on inhibition rate

从图2可以看出：当苦瓜皂甙的浓度在0～8mg范围内，抑制率随着浓度的增大而增大，即提高对于胰脂肪酶活性的抑制程度；当浓度在8 mg～10 mg范围内，随着浓度的增大，抑制率的提高逐渐趋于平缓，由图2可以计算出IC50为0.384 7 mg/mL。

3 结论

苦瓜皂甙最佳浸提条件为：浸提时间77 min、乙醇浓度 50%、浸提温度 38℃，料液比 1∶13.5（g/mL），浸提次数1次；此条件下苦瓜皂甙产率达到1.419 1%；所得苦瓜皂甙对胰脂肪酶的IC50值为0.384 7 mg/mL。