晚期糖基化终产物诱导小鼠胰岛素抵抗的研究

董璐，吴玥琨，吴亚敬，张燕

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，食品营养与安全国家重点实验室，天津300457；2.南开大学医学院，天津市食品科学与健康重点实验室，天津300071）

蛋白质是生物体内最丰富且功能多样的生物大分子。蛋白质的独特构象决定了它的功能特性，这种构象可以被体内多种化学途径所干扰，造成蛋白质损伤，从而导致机体病变[1-3]。非酶促糖化，也称为美拉德反应，是蛋白质损伤的途径之一[4]。反应过程中活性羰基化合物与蛋白质氨基基团结合，导致机体蛋白质共价损伤，并形成内源性晚期糖基化终产物（advanced glycation end products，AGEs），这被认为与许多人类疾病的发病机制相关，如糖尿病及其并发症，动脉粥样硬化和阿尔茨海默病等[5-10]。根据流行病学调查显示，体内AGEs水平升高是1型糖尿病[11]、β细胞损伤[12-15]及外周胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）[16-17]的重要危险因素，此发现引起了研究人员追溯AGEs水平升高的根源的兴趣。有科学家认为在高度工业化的现代饮食环境中富含丰富的AGEs及其前体物质可能解释此现象[18]。

食物中外源性AGEs主要是由醛类化合物结合胺或酰胺通过美拉德反应形成，但是由于食品基质及美拉德反应的复杂性，导致AGEs前体物较多，与内源性AGEs相比，形成的AGEs具有极强的异质性[19]。现代饮食中充满了热处理食物，这些食物有助于增加机体AGEs的摄入[20]。据估计，人们每天可以通过牛奶和烘焙产品膳食摄入AGEs量为25 mg/d至75 mg/d[21]。已有研究显示，膳食AGEs摄入量与血浆游离AGEs相关[22]。虽然外源性AGEs和内源性AGEs被认为是两个独立的来源，但最近观察到它们可能协同作用并导致总体糖毒素负担，这可能增加AGEs对健康的危害影响[20]。Borg等[23]以AIN-93饲料作为低剂量AGEs组，高温加热（165℃）烘焙的AIN-93饲料作为高剂量AGEs组，研究膳食摄入AGEs对胰岛β细胞损伤的影响，结果表明高剂量膳食摄入AGEs会对胰岛β细胞造成损伤。但是由于饲料基质组成复杂，高温加热不仅增加AGEs的含量，同时也增加饲料中其它有害物的含量，如糖氧化产物，脂质氧化产物，α-二羰基化合物等，均可在体内引起机体AGEs的生成[24]，所以不能完全证明AGEs的作用。Li等[25-26]分别研究野生型大鼠和高脂饮食喂养大鼠暴露于游离态Nε-羧甲基赖氨酸后对大鼠机体的损伤，结果表明游离态Nε-羧甲基赖氨酸可对大鼠肾脏造成损伤。但目前还鲜少有关于膳食摄入蛋白质结合态AGEs对机体损伤的报道，所以填补此研究空白是十分必要的。

本研究以丙酮醛修饰β-乳球蛋白产物（methylglyoxal modified β-lactoglobulin product，MG-bLG）为蛋白质结合态AGEs的代表物，通过灌胃摄入方式测定AGEs对昆明（KM）小鼠体重、摄食量、空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、空腹胰岛素（fasting insulin，FINS）、血脂、血清中AGEs水平及IR相关指标的影响，来研究蛋白质结合态AGEs对机体IR的促进作用，以期为蛋白质结合态AGEs诱导机体IR提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

Multiskan Sky全波长酶标仪：美国Thermo公司；Accu-Chek罗氏活力血糖仪、Accu-Chek罗氏活力血糖试纸：德国罗氏诊断公司；冷冻离心机Microfuge 20R：美国贝克曼公司。

1.2 实验动物及饲料

昆明小鼠（KM，雄性、6周龄）：北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXX（京）2016-0006，合格证No.11400700294047，于天津科技大学实验动物中心饲养，饲养环境达到净化级别。大小鼠维持饲料：斯贝福（北京）生物技术有限公司，组成成分：粗蛋白≥180 g，粗脂肪≥40 g，粗纤维≤50 g，水分≤100 g。

1.3 试验方法

1.3.1 MG-bLG的制备

配置MG与bLG的反应溶液，使MG和bLG在0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中的终浓度分别达到2 mmol/L和1.8 mg/mL。将反应溶液在100℃下孵育1 h，待反应结束后立即进行超滤以除去未反应的MG。将溶有MG修饰的bLG产物（MG-bLG）的溶液冷冻干燥得到MG-bLG粉末。将MG-bLG重溶于0.9%生理盐水中，至终浓度为2 mg/mL用于实验灌胃所用。

1.3.2 动物饲养

在金融全面去杠杆的大政策背景之下，无论是机构信贷还是个人信贷都将面临收紧。通过对现金贷更严格的监管，个人杠杆率，尤其是信用较差个人的杠杆率，将有一定程度的降低。通过对现金贷平台自身杠杆率的控制，现金贷行业的风险将进一步被抑制。通知规定，小贷公司通过信贷资产转让、ABS方式获得的资金也要进入杠杆率计算，杜绝了现金贷平台表外融资，进一步降低了现金贷行业的整体杠杆率。

雄性6周龄SPF级KM小鼠30只，进行1周适应性喂养，随机分为2组，空白对照组[C组，体重（36.1±1.3）g]，实验组[MG-bLG 组，体重（35.8±1.7）g]。C 组每天灌胃与MG-bLG组体积相同的0.9%生理盐水，MG-bLG组每天灌胃0.2 mL MG-bLG（2 mg/mL，溶于0.9%生理盐水），连续灌胃6周。饲养条件：每笼5只小鼠，温度（22±2）℃，湿度（50±5）%，12 h昼夜交替光照，自由摄食饮水，喂养6周后停止喂养。

1.3.3 血清样本收集及保存

喂养结束后，小鼠禁食12 h后，眼球取血，全血4℃条件下4 000 r/min离心15 min，分离获得血清，分装后于-80℃冰箱保存。

1.3.4 FBG值的测定

动物喂养过程中，每周测定一次小鼠空腹血糖值。测定之前小鼠断粮12±0.5 h，采用尾静脉取血方式测定小鼠血糖值作为空腹血糖值。实验开展前测定1次空腹血糖作为0点空腹血糖值。

1.3.5 FINS水平测定

FINS水平使用小鼠胰岛素ELISA试剂盒测定，测定方法按照说明书操作。

1.3.6 血清中血脂含量测定

分别测定血清中LDL-C、HDL-C、T-CHO和TG含量，测定方法按照相应测试盒说明书操作。

1.3.7 IR相关指数分析

采用homeostasis model assessment（HOMA）稳态模型[27]评价 IR 水平（HMOA-IR）、胰岛素敏感性（insulin sensitivity，IS）水平（HOMA-IS）及胰岛β细胞功能（HOMA-β）。计算公式如下：

HOMA-IR=FBG×FINS/22.5

HOMA-IS=22.5/（FBG×FINS）

HOMA-β=20×FINS/（FBG-3.5）

式中：FBG为空腹血糖值，mmol/L；FINS为空腹胰岛素值，mU/L；22.5/20/3.5为各公式常量系数。

1.3.8 血清中AGEs含量

采用ELISA测定小鼠血清中AGEs含量，操作步骤按试剂盒说明书进行。

1.4 数据统计与分析

结果采用均值±标准差表示。采用SPSS 24进行统计学分析，P＜0.05说明差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 MG-bLG对小鼠体重和摄食量的影响

MG-bLG对小鼠体重和摄食量的影响如表1所示。

在灌胃MG-bLG前（0周），MG-bLG组小鼠体重与C组小鼠体重相比，不具有显著性差异。经2周的灌胃干预，MG-bLG组小鼠体重与C组小鼠体重比较出现显著性差异（P＜0.05），灌胃持续至 6周，MG-bLG组小鼠的体重较于C组分别增加4.03%、4.79%、6.84%、8.55%和9.77%。在实验过程中，MG-bLG组小鼠的摄食量高于C组，说明MG-bLG组小鼠的体重重于C组小鼠的体重可能是由摄食量的不同而引起。此结果与现有研究结果相一致，AGEs有刺激食欲的功能，可以造成机体营养过剩[28]。

表1 MG-bLG对小鼠体重及摄食量的影响Table 1 The effect of MG-bLG on body weight and food intake in mice

2.2 MG-bLG对小鼠血脂的影响

在2型糖尿病和IR的研究中发现，个体除了表现为糖代谢异常外，还会发生脂质代谢紊乱现象[29]。MG-bLG对小鼠血脂的影响如表2所示。

表2 MG-bLG对小鼠血清血脂的影响Table 2 The effect of MG-bLG on serum lipids in mice

由表2可知，经长时间摄入MG-bLG，MG-bLG组小鼠 LDL-C、TG、T-CHO 水平分别为 0.31、1.10、2.60 mmol/L，显著的高于 C 组（P＜0.05），HDL-C 水平无显著变化。说明长期摄入MG-bLG引起小鼠脂质代谢变化。

2.3 MG-bLG对小鼠血糖的影响

MG-bLG对小鼠血糖的影响如图1所示。

由图1可知，MG-bLG组小鼠0～6周FPG平均值分别为 5.2、5.1、6.4、6.8、7.0、7.1、7.1 mmol/L，随着灌胃时间的延长，FPG值增大。经灌胃MG-bLG 3周后，MG-bLG组小鼠的FPG水平显著高于C组（P＜0.05）。膳食干预4周后，MG-bLG组小鼠FPG值均在7.0mmol/L以上。说明长时间摄入MG-bLG可增高小鼠的FPG水平。

图1 MG-bLG对小鼠FBG的影响Fig.1 The effect of MG-bLG on FBG in mice

2.4 MG-bLG对小鼠FINS的影响

MG-bLG对小鼠FINS的影响如图2所示。

图2 MG-bLG对小鼠FINS的影响Fig.2 The effect of MG-bLG on fasting insulin in mice

经灌胃6周MG-bLG后，MG-bLG组小鼠FINS水平为14.8 mU/L，显著高于（P<0.05）C组小鼠的FINS水平（12.5 mU/L）。血糖浓度升高可刺激胰岛β细胞增加胰岛素合成及分泌，以维持机体血糖平衡，而MG-bLG组FINS水平显著高于C组，说明MG-bLG可促进小鼠血糖水平升高，促进机体合成分泌胰岛素，从而导致胰岛素水平升高。

2.5 IR相关指数分析

IR相关指数结果如表3。

表3 IR相关指数Table 3 Insulin resistance related index

MG-bLG组的HOMA-IR水平为4.86，显著高于C 组的 3.12（P<0.05），MG-bLG 组的 HOMA-IS指数为0.21，显著低于C组的0.28（P<0.05），说明小鼠长时间摄入MG-bLG会增加胰岛素抗性，降低胰岛素敏感性。MG-bLG组的HOMA-β指数为84.94%，低于C组的107.79%，但无显著性差异，说明MG-bLG对小鼠胰岛β细胞无显著性影响。通过上述分析可知，MG-bLG可通过促进IR，从而增大2型糖尿病风险。

2.6 血清中AGEs水平

MG-bLG对小鼠血清中AGEs水平的影响如图3所示。

图3 MG-bLG对小鼠血清AGEs水平的影响Fig.3 The effect of MG-bLGon the concen tration of AG Esinmice

由图3可知，与C组相比，灌胃摄入MG-bLG后，小鼠血清中AGEs水平升高至131.99 pg/mL，是C组AGEs水平（43.88 pg/mL）的 3倍（P<0.05），说明 MG-bLG可以促进小鼠体内AGEs的累积，此结果与现有关于胰岛抵抗和2型糖尿病模型中的研究结果一致。有研究表明，2型糖尿病患者体内AGEs含量高于健康个体[30]。通过HOMA-IR评估发现AGEs的循环水平与胰岛素抵抗相关，即使在非肥胖的非糖尿病受试者中也是如此[31]。说明MG-bLG的长时间摄入可导致机体内AGEs水平升高。

3 结论

MG-bLG摄入导致小鼠体重和摄食量增大，FBG升高，并促进胰岛素的合成和分泌增到，进而导致HOMA-IR增大，HOMA-IS减小。此外小鼠血清内AGEs水平升高，LDL-C、TG和T-CHO水平升高，说明长时间摄入蛋白质结合态AGEs可改变机体糖脂代谢，促进机体IR，增加机体患2型糖尿病的风险。因此，应尽量降低饮食中摄入过多的蛋白质结合态AGEs，以免其诱导机体IR甚至是糖尿病的发生。