肥大细胞在小鼠佐剂性关节炎疼痛中的作用及其机制研究*

董甜甜，王金龄，李世刚，柳 蔚，闫梦真，余 婕，陈桂婷，周婷婷

（三峡大学医学院，湖北宜昌443002）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性自身免疫性疾病，以滑膜增生，关节软骨与骨的破坏为特征，伴有慢性持续性的关节疼痛，严重危害患者的身心健康，影响患者的生活质量［1］。世界范围内大约1%的人口患有RA［2］，大部分都遭受着疼痛的折磨，临床使用糖皮质激素［3］、传统抗风湿药和解热镇痛药并不能达到理想镇痛效果，且易出现一系列的药物耐受现象和副作用［4-5］；为减轻更多RA患者的痛苦，提高整体生活质量，迫切需要了解关节疼痛的发生发展机制，以发现新的治疗靶点，寻找新的风湿镇痛药。

肥大细胞来源于骨髓造血干细胞［6］，离开骨髓后以肥大细胞前体形式随血流迁移，最后定居于全身各处结缔组织中增殖分化为成熟的肥大细胞介导免疫反应，其一旦活化可脱颗粒释放出多种炎性介质，包括类胰蛋白酶（tryptase）、组胺（histamine）和肝素（heparin）和神经生长因子（never growth factor，NGF）等。早期研究发现肥大细胞在RA的病理发生发展过程中扮演重要角色，RA患者和实验性关节炎小鼠滑膜组织中肥大细胞数量和活化的肥大细胞数较正常滑膜组织明显增加，而肥大细胞缺乏的小鼠关节炎症明显减轻［7-8］，证实了肥大细胞在RA的发生发展过程中可能起着关键性作用。

肥大细胞在其它疾病所致疼痛过程中也发挥重要作用。例如，镰状细胞性贫血导致的疼痛过程中皮肤组织肥大细胞脱颗粒增加，而经肥大细胞稳定剂处理的小鼠和肥大细胞缺乏的KitW-v小鼠痛觉过敏反应减轻［9］；肥大细胞缺乏的Kitw-sh小鼠诱导慢性膀胱炎，其炎症病理表现和盆腔疼痛较野生型小鼠明显减轻，对其进行C57BL/6J小鼠骨髓来源的肥大细胞再移植后，盆腔疼痛和病理表现再次出现，经H1和H2受体拮抗剂治疗后盆腔疼痛缓解［10］。这说明肥大细胞及其脱颗粒介质在慢性炎症性疼痛病理中可能发挥作用。

虽然肥大细胞参与多种疾病疼痛病理过程，却未见肥大细胞与RA疼痛的相关报道，本研究基于肥大细胞在RA炎症病理过程中发挥的作用，推测肥大细胞可能也介导了关节炎疼痛的发生。本项工作采用完全弗氏佐剂（complete Freund′s adjuvant，CFA）构建小鼠佐剂性关节炎（adjuvant arthritis，AA）疼痛模型［11］，探讨肥大细胞在RA关节疼痛中的作用及其可能机制。

材料和方法

1 材料

SPF级雌性C57BL/6小鼠18只，体重20～30 g，周龄为6～8周，购自湖北省实验动物研究中心，许可证号为SCXK（鄂）2015-0018。雌性KitW-4Bao小鼠（Kit基因突变小鼠，背景品系为C57BL/6J小鼠，体内肥大细胞缺乏）6只，体重20～30 g，由杭州师范大学实验动物中心提供，许可证号为SCXK（浙）2011-0048。PL-200热刺痛仪（成都泰盟科技有限公司）；von Frey电子测痛仪（ALMEMO 2390-5，AHLBORN）；游标卡尺（东莞市景有模具五金有限公司）；多功能显微镜及图像分析系统（Leica）；酶标仪（Tecan）。CFA（Chondrex）；甲苯胺蓝（toluidine blue，TB；武汉谷歌生物科技有限公司）；色甘酸钠（cromolyn sodium，CS；一种肥大细胞稳定剂；上海生工生物工程有限公司）；ELISA试剂盒（上海鑫乐生物科技有限公司）。

2 实验方法

2.1 动物分组及给药 将正常雌性C57BL/6小鼠随机分为3组：正常对照组（control组）、AA模型组（model组）和AA模型+CS组（CS组），每组6只。6只雌性KitW-4Bao小鼠（Kit基因突变小鼠，背景品系为C57BL/6J小鼠，表现为肥大细胞缺乏）作为AA模型+肥大细胞缺失组（W-4Bao组）。除control组注射等体积生理盐水外，其它各组小鼠右后足底皮下注射CFA 30 μL构建AA模型［11-12］，1 d后观察到注射侧足掌明显红肿说明造模成功。CS组小鼠在CFA注射1 d后开始腹腔注射CS（20 mg/kg）［9］，其余各组小鼠均给予等体积生理盐水，每日1次，持续给药14 d。

2.2 小鼠足趾肿胀度测定 分别于小鼠致炎第0、1、3、7、10和14天使用游标卡尺测量小鼠双后肢的足掌厚度［13］。

2.3 机械刺激缩爪反应阈值（paw withdrawal threshold，PWT）测量 分别在致炎第0、1、3、7、10和14天使用von Frey电子测痛仪检测机械疼痛阈值［12］。将小鼠置于透明的玻璃器皿下，底为1 cm×1 cm孔径的铁丝网，待小鼠适应30 min后开始检测。用一根连接在von Frey电子测痛仪探头上的金属丝（直径约为0.5 mm）垂直向上刺激小鼠足底，小鼠抬足的瞬间记录下疼痛阈值（g），每只足重复测量3次取平均值，每次测量间隔15 s。

2.4 热刺激缩爪反应潜伏期（paw withdrawal latency，PWL）测量 在小鼠致炎第0、1、3、7、10和14天使用热刺痛仪检测小鼠缩爪反应时间［12］。测定前，将小鼠置于热刺痛仪的玻璃板上，并用透明玻璃杯限制其活动范围，适应环境30 min，待小鼠处于安静状态时，开始进行检测。移动辐射热光源，对准小鼠后足贴近玻璃板的部位，从给予辐射热刺激开始计时，直至大鼠产生缩爪反应时记录下缩爪反应潜伏时间（s）。每只小鼠测试间隔10 min以上，测试3次取平均值。

2.5 关节组织病理评价 14 d后处死小鼠，获取右后肢踝关节，4%多聚甲醛固定后，组织浸于10%EDTA进行脱钙，至骨组织变软后进行常规脱水，石蜡包埋切片。切片进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，在光学显微镜下观察踝关节组织的病理改变，进行关节炎评分［12］：根据组织病变程度分为4级，逐级记为0～3分，累计总分为关节组织病理分数，最严重的病理评分可达9～10分，见表1。

表1 关节组织病理评分系统Table 1.Joint histopathology scoring system

2.6 TB染色 小鼠踝关节组织石蜡切片经常规脱蜡水化后用0.5%TB染液染色5 min，冲洗后冰醋酸分化数秒，经脱水，二甲苯透明后封片。切片在光学显微镜下观察到的含紫红色颗粒的细胞为肥大细胞，其中细胞膜完整、细胞核染色清楚的为稳定状态肥大细胞；细胞膜破裂、周围组织中存在蓝染颗粒的为脱颗粒肥大细胞［14］。选取不同视野进行肥大细胞计数，每张切片选择3个视野进行计数，求平均值，并计算肥大细胞脱颗粒率。脱颗粒率（%）=脱颗粒肥大细胞数量/肥大细胞总数×100%。

2.7 酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法检测小鼠踝关节组织中炎症因子和神经肽水平 取小鼠踝关节加入PBS进行组织匀浆，吸取上清，参考ELISA试剂盒说明书检测上清中histamine、tryptase、P物质（substance P，SP）和降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）的浓度［15］。

3 统计学处理

实验数据应用GraphPad Prism 5软件进行分析，计量资料以均数±标准差（mean±SD）表示，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计，组间均数多重比较采用LSD-t检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 小鼠致炎前后足趾肿胀度

小鼠注射CFA 1 d后，致炎侧后肢肉眼可见明显红肿，对侧及注射生理盐水的小鼠未见明显改变；经测量，与正常control组相比，model组小鼠的右侧足掌厚度在致炎1 d后显著增加（P＜0.05），肿胀持续至14 d，小鼠伴有跛行和舔足反应，见图1。

2 热刺激（PWL）和机械刺激（PWT）痛敏反应

小鼠致炎1 d后，注射CFA的一侧后肢PWL和PWT较control组显著降低（P＜0.05），痛觉过敏持续至14天，对侧后肢以及正常control组的后肢未见明显疼痛反应，与注射CFA的model组野生型小鼠相比，KitW-4Bao小鼠痛阈值保持在较高水平（P＜0.05）；经CS干预治疗后的第7天开始，小鼠PWL和PWT逐渐升高，与model组小鼠相比有显著差异（P＜0.05），见图1。

3 关节组织病理评分

组织切片经HE染色显示，control组关节面光滑，未见炎症细胞浸润和滑膜增生；model组关节腔狭窄，伴有大量炎症细胞浸润、关节滑膜增生等典型关节炎病理表现；CS组较model组炎症表现明显减轻，炎症细胞，滑膜增生减少；W-4Bao组炎症症状不明显。组织病理分数统计分析结果显示model组小鼠评分显著高于control组（P＜0.05），W-4Bao组和CS组的评分显著低于model组（P＜0.05）。见图2。

Figure 1.The swelling of the paw and the pain threshold before and after the inflammation in mice.A：visual observation of right hind paw swelling in mice；B：ankle thickness change in control group and model group.C：the changes of paw withdrawal latency in control group，model group，W-4Bao group and CS group；D：the changes of paw withdrawal threshold in control group，model group，W-4Bao group and CS group.Mean±SD，n=6.*P＜0.05 vs control group，#P＜0.05 vs model group.图1 小鼠致炎前后足掌肿胀情况和痛域变化

4 肥大细胞脱颗粒情况

Figure 2.HE staining and pathological score of mouse joint tissues in control group（A），model group（B），W-4Bao group（C）and CS group（D）.The scale bar=100 μm.The arrows indicate joint cavity narrowing，synovial hyperplasia，and inflammatory cell infiltration.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group.图2 关节组织病理评分

踝关节组织切片TB染色结果显示，model组较control组总的肥大细胞数量和脱颗粒的肥大细胞均显著增加（P＜0.05），W-4Bao组几乎未见肥大细胞，CS组较model组的肥大细胞数量及脱颗粒率均显著降低（P＜0.05），见图3。

Figure 3.The number of mast cells and the degranulation rate of mast cells in mouse joint tissues in control group（A），model group（B），W-4Bao group（C）and CS group（D）were evaluated by toluidine blue staining（scale bar=20 μm）.The red arrows indicate stable mast cells，while the yellow arrows indicate degranulated mast cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group.图3 踝关节组织肥大细胞活化情况

5 踝关节组织炎症因子和神经肽释放情况

ELISA法检测结果显示，model组中histamine、tryptase、SP和CGRP的表达量均比control组显著升高（P＜0.05），其在CS组和W-4Bao组中的表达量较model组显著降低（P＜0.05），见表2。

表2 各组踝关节组织炎症因子和神经肽释放水平比较Table 2.Comparison of release levels of inflammatory factors and neuropeptides in ankle joint tissues of each group（μg/L.Mean±SD，n=6）

讨 论

目前国内外针对肥大细胞在RA中的作用研究多集中在炎症方面，对RA疼痛研究较少。弗氏佐剂关节炎可产生动物自身免疫反应性炎症，模拟RA引起的疼痛，属于慢性疼痛模型，适用于RA疼痛发病机制及镇痛药物作用的研究［13］。本实验通过小鼠右后肢足底皮下注射CFA，构建AA疼痛模型，1 d后小鼠注射侧明显红肿，活动受限并伴随一些疼痛反射行为，提示造模成功。

肥大细胞在组织中通常邻近血管和神经分布，肥大细胞脱颗粒可调节神经兴奋性，反过来神经元释放的神经递质也可活化肥大细胞。在交感神经元与大鼠嗜碱性粒细胞性白血病RBL-2H3细胞以及大鼠腹腔肥大细胞共培养实验中，观察到神经元和肥大细胞的膜与膜之间形成类似突触样联系，用缓激肽刺激神经细胞可观察到RBL-2H3细胞活化并出现细胞膜的波动现象［16］，这一现象直观表明了肥大细胞与神经之间存在着某种内部联系，为肥大细胞在疼痛病理过程中发挥作用提供了依据。

机械和热刺激痛阈的测定被广泛用于评估实验动物疼痛等级。为证实肥大细胞在CFA诱导的AA疼痛中的作用，本研究采用肥大细胞缺乏的KitW-4Bao小鼠［17］诱导AA模型，同时对AA模型小鼠使用肥大细胞稳定剂CS进行干预治疗。实验结果显示：model组小鼠的PWL和PWT较control组显著降低，而CS组和W-4Bao组小鼠痛阈均高于Model组，从疼痛行为学的角度证实肥大细胞能够促进关节炎疼痛的发生。

肥大细胞在组织免疫炎症状态下，通过脱颗粒释放出多种炎性介质，如histamine和tryptase等，通过炎性介质与组织细胞的相互作用，放大炎症信号，导致持续性的慢性炎症发生和发展［18-19］。本实验通过TB染色观察肥大细胞在踝关节组织中的分布及活化情况，结果观察到control组踝关节组织中肥大细胞数量以及活化数量较少，而model组中肥大细胞数量和活化脱颗粒的肥大细胞数量显著增加，肥大细胞缺乏的W-4Bao组以及使用肥大细胞稳定剂处理后的CS组的肥大细胞活化程度均减轻。ELISA检测踝关节组织匀浆中炎症介质histamine和tryptase的释放情况，结果显示model组中这两种炎症介质含量较control组明显增加，而CS组和W-4Bao组较model组含量降低，表明CFA诱导的关节炎能够促进肥大细胞活化，组织中肥大细胞数量与关节炎症严重程度具有一定关系，抑制肥大细胞活化能有效缓解关节炎症和疼痛。

SP和CGRP是在疼痛过程中起重要作用的神经递质，广泛分布于中枢神经系统和外周神经系统，由感觉神经元分泌，在伤害性机械、热和化学等刺激下，神经末梢被激活可释放大量SP和CGRP，在慢性炎症疼痛中发挥重要作用。先前的研究证实关节中存在大量的肽能神经元能够分泌SP和CGRP，在胶原诱导的关节炎中观察到背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）神经元和脊髓背角中CGRP表达上调，痛觉敏感性增强［20］；在CFA诱导的大鼠慢性膝关节炎模型中出现同侧小直径DRG神经元CGRP阳性表达率明显增加［21］。有研究［22］表明雷公藤甲素能够抑制AA大鼠脊髓背角和DRG中SP的表达，并缓解了50%机械缩足反应阈值。对于慢性关节炎症（RA和骨关节炎）的研究显示关节炎病人血清SP浓度与慢性疼痛强度呈正相关关系［23］，在炎症状态下，关节周围组织中的神经纤维及相应受体被激活，可释放神经肽引起痛敏，SP和CGRP的释放可能是导致关节炎疼痛的重要原因。

本实验检测了小鼠踝关节组织中SP和CGRP的释放情况，结果显示与control组相比，CFA诱导的model组小鼠痛敏反应明显增强，伴随SP和CGRP浓度显著增加，此结果与相关文献报道一致，SP和CGRP浓度与关节疼痛有联系。CS处理的CS组和肥大细胞缺乏的W-4Bao组较model组神经肽的释放显著减少，提示肥大细胞能够调控小鼠踝关节组织中神经肽的分泌，进而影响关节炎疼痛的发生，这一过程可能和肥大细胞与关节神经末梢之间的相互作用有关。

神经免疫系统相互作用机制在多种疾病中已有报道，本实验展示了CFA诱导的小鼠慢性AA使关节痛敏反应增强，促进了肥大细胞的活化和神经肽的释放；而肥大细胞缺乏的小鼠和使用肥大细胞稳定剂处理过的小鼠能够有效减轻关节炎症，缓解关节疼痛，减少了神经肽SP和CGRP的释放，表明肥大细胞是促进AA疼痛发生的重要中介，首次阐述了肥大细胞在关节炎疼痛中发挥重要作用，为治疗RA疼痛提供了新的治疗思路。然而肥大细胞与关节组织中伤害性感受神经元之间具体的相互作用尚不清楚，它们之间是否存在着密切的联系有待进一步探讨，以更加明确肥大细胞在关节疼痛中的作用机制，为寻找更明确的关节疼痛治疗靶点提供更坚实的依据。