舒洛地特通过抑制NOX4/NLRP3通路减轻高糖诱导的视网膜血管损伤*

李 婷，何学敏，彭荣东，李静仁，付夏楠，周 丽，石国军△，陈燕铭△

（1中山大学附属第三医院内分泌与代谢性疾病科，广东省糖尿病防治重点实验室，广东广州510630；2中山大学附属第三医院临床免疫中心，广东广州510630）

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）常见的微血管并发症，是成年人最常见的致盲性眼病［1］，由于其缺乏特异性的治疗方法，重点在于早期筛查早期防治，研究其发病机制及防治方法具有重大现实意义。内皮细胞是视网膜微血管的重要组成部分，对维持视网膜微血管的结构和功能完整性起重要作用。炎症与DR的发生发展密切相关，DR患者［2］的房水和血清中都发现了白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6等炎症相关因子的增加。因此，抑制促炎症分子，保护内皮细胞，减轻DR的血管渗漏［3］，是目前研究的热点。

IL-1β是核苷酸结合寡聚域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体（inflammasome）激活后产生的促炎介质之一，敲除IL-1β受体基因缓解了小鼠DR的进展［4］。NLRP3炎症小体是一个分子复合体，由3个部分组成：感受蛋白为NLRP3，衔接蛋白为含胱天蛋白酶募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC），效应蛋白为前体胱天蛋白酶1（procaspase-1，Pro Casp-1）。NLRP3在DR中被激活［5］。抑制NLRP3炎症小体可保护糖尿病诱导的内皮细胞间紧密连接蛋白1（zonula occludens-1，ZO-1）和VE-钙黏着蛋白（VE-cadherin，VE-Cad）［6］，这是减轻血管渗漏重要的一环。

活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）对内皮细胞有损伤作用［7］。NADPH 氧化酶（NADPH oxidase，NOX）是脉管系统ROS主要的来源之一［8］。高糖刺激下，内皮细胞中NOX4/ROS激活并诱导NLRP3炎症小体活化［9］；ROS还可通过降解细胞间黏附蛋白损伤内皮细胞［10］。另外，研究表明DR患者中ROS升高［11］。这些研究表明，NOX4是诱导DR氧化应激和血视网膜屏障分解的关键分子。

舒洛地特（sulodexide，SDX）由80%的低分子肝素和20%的硫酸皮肤素构成，属于葡糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAGs）［12］。临床研究显示，SDX 干预的糖尿病患者视网膜的渗漏减少［13］，提示SDX具备治疗DR的潜能。在体外实验中，SDX在内皮细胞中抑制高糖诱导的ROS生成和炎症因子分泌［14］，提示SDX可能具有抑制NOX等酶活性的作用。

本研究旨在探索SDX对糖尿病视网膜尤其是视网膜微血管内皮细胞的影响及其潜在机制。本课题组前期研究提示SDX干预减轻了DR小鼠的视网膜渗漏，NLRP3炎症小体也同时减少［15］。因此，本研究重点关注SDX抑制NLRP3炎症小体活化的机制。

材料和方法

1 动物与细胞

6周龄的C57BL/6小鼠购自广东省医学实验动物中心，生产许可证号为SCXK（粤）2013-0002，饲养于广东省动物监测所。人视网膜微血管内皮细胞（human retinal microvascular endothelial cells，HRMECs；cap-0010）购于Angio-Proteomie。

2 主要试剂

小鼠抗人和小鼠NLRP3多克隆抗体（1∶1 000，AG-20B-0014-C100）购自Adipogen；兔抗人NOX4单克隆抗体（1∶1 000，ab133303）、兔抗人Pro Casp-1+p10+p12多克隆抗体（1∶1 000，ab179515）、兔抗人VE-Cad多克隆抗体（1∶1 000，ab333168）及兔抗人和小鼠ZO-1多克隆抗体（1∶1 000，ab59720）购自Ab-cam；Alexa Fluor®488偶联的同工凝集素（isolectin）GS-IB4（1∶5 000，I21411）购自Invitrogen。

3 主要方法

3.1 实验动物模型建立 6周龄的C57BL/6小鼠分为对照（control，Con）组和DM组，分别接受10%脂肪饲料或60%高脂饲料。4周后DM组和Con组小鼠分别用40 mg/kg链脲佐菌素（streptozocin，STZ）和等体积柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液腹腔注射，连续注射5 d后随机血糖高于16.7 mmol/L者为糖尿病模型造模成功。

3.2 舒洛地特治疗 造模成功后随即进行为期3个月的药物干预，用随机数法将小鼠分为DM+SDX组、DM+生理盐水（normal saline，NS）组、Con+SDX组及Con+NS组。DM+SDX组和Con+SDX组腹腔注射SDX（10 mg/kg），而DM+NS和Con+NS组腹腔注射等体积生理盐水，每2 d一次，持续12周。

3.3 伊文思蓝尾静脉注射 通过尾静脉给小鼠注射30 mg/kg的伊文思蓝，随后将小鼠静置于37℃热毯上2 h。直接摘取小鼠右侧眼球在4%多聚甲醛中固定15 min后进行铺片，观察视网膜血管渗漏情况（激发波长620 nm，发射波长740 nm）。用37℃的PBS进行心脏灌注后剥离左侧视网膜于甲酰胺中，在冰上超声裂解后于70℃水浴18 h，500 000×g离心45 min，取上清液于620 nm波长检测吸光度（A）。

3.4 HRMECs处理 用125、250、500和1 000 LSU/L（LSU即lipasemic unit，脂酶单位）4个浓度的SDX处理HRMECs 24 h。阴性对照siRNA（si-NC）和沉默NOX4的siRNA（si-NOX4）用于转染HRMECs。对照腺病毒（ad-GFP）和过表达NOX4的腺病毒（ad-NOX4）以MOI=20感染细胞。

3.5 Western blot 上样量30 μg，转膜后用7%的脱脂牛奶室温封闭1 h，TBST洗膜后用I抗孵育8～16 h（I抗稀释比例见“2 主要试剂”），其后用II抗于4℃孵育3 h，洗膜后用ECL法显影，用ImageJ软件分析条带灰度。

3.6 免疫荧光技术 用4%多聚甲醛室温固定切片或细胞10 min，PBST浸洗后用溶于1%BSA的0.2%Triton X-100在室温下固定破膜1 h，再用PBST浸洗；加入I抗，湿盒中4℃孵育过夜；其后用PBST浸洗，加入Alexa Fluor®555偶联或Alexa Fluor®647偶联的荧光II抗室温孵育1 h，浸洗后封片拍摄。

3.7 ROS检测 用DCFH-DA探针试剂盒检测细胞内产生的ROS。细胞种在48孔板或者96孔板里，进行相应处理后，在黑暗中与10 μmol/L的DCFH-DA反应30 min，然后用PBS洗涤两次。随后可在酶标仪和荧光显微镜中检测或观察ROS产生的情况。

4 统计学处理

采用GraphPad Prism软件进行统计学分析，统计结果以均数±标准误（mean±SEM）表示。实验均重复3次及以上。符合正态分布及方差齐性的两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）及 Bonferroni’s post hoc test。不符合正态分布的数据使用秩和检验进行分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 SDX减轻糖尿病小鼠视网膜微血管渗漏

DM+NS组与DM+SDX组在SDX治疗前后血糖无显著差异，见图1A。视网膜铺片结果显示，DM+NS小鼠的视网膜微血管渗漏较Con+NS组显著增加，而DM+SDX组的视网膜渗漏较DM+NS组显著减少（P＜0.05），见图1B、E。另外，我们发现DM+NS组的微血管密度较Con+NS组下降，而DM+SDX组相比于DM+NS组，微血管密度显著上升（P＜0.05），见图1C、F。HE染色结果提示，神经节细胞数量在DM+NS组中显著减少，而DM+SDX组较DM+NS组增多（P＜0.05），见图1D、G。

2 SDX减轻糖毒性引起的内皮细胞损伤

Western blot结果显示，ZO-1在DM+NS组小鼠视网膜组织中的表达量下降，而DM+SDX组的ZO-1表达量较DM+NS组显著上升（P＜0.05），见图2A。在HRMECs中，高糖刺激明显降低了ZO-1和VE-Cad的表达，而在高糖刺激同时加入SDX的HRMECs中，ZO-1和VE-Cad的表达水平显著提高（P＜0.05），见图2B。细胞免疫荧光结果提示，高糖处理的HRMECs之间VE-Cad减少，而SDX与高糖共处理的HREMCs之间VE-Cad表达部分恢复（P＜0.05），见图2C。

3 舒洛地特在体内抑制高糖导致的NLRP3炎症小体激活

Western blot结果提示，NLRP3、Pro Casp-1及其活化状态的剪切体（cleaved Casp-1）在DM+NS组中升高，而在DM+SDX组比DM+NS组显著下降（P＜0.05），见图3A。NLRP3和GS-IB4共染的视网膜铺片结果显示，NLRP3在视网膜上的表达与GS-IB4高度吻合，提示NLRP3主要在血管内皮中表达；NLRP3在DM+NS组中升高，而在DM+SDX组比DM+NS组下降（P＜0.05），见图3B。

Figure 1.Intraperitoneal injection of sulodexide（SDX）protected diabetic mouse retinas from blood-retina barrier breakdown，vascular leakage，reduction of microvascular density and loss of ganglion cells.A：blood glucose of mice（n=15～20）；B and E：representative images（B；the upper scale bar=1 μm；the lower scale bar=100 μm）and quantification（E；n=3） of retinal vascular leakage（indicated by with arrows）；C and F：representative images（C；scale bar=25 μm）and quantification（F：n=7～10）of microvascular density.D and G：HE staining of retinal sections at the analogous positon of eyeballs（D；scale bar=25 μm）and quantification of ganglion cell number（G；n=12～18）.GCL：ganglion cell layer；INL：inner nuclear layer；ONL：outer nuclear layer；RPE：retinal pigmented epithelium.Mean±SEM.*P＜0.01 vs Con+NS group；#P＜0.05 vs DM+NS group.图1 SDX治疗减轻糖尿病小鼠视网膜微血管渗漏，提高微血管密度及神经节细胞数

4 SDX在HRMECs中抑制高糖导致的NLRP3炎症小体激活

Western blot结果显示，125 LSU/L的SDX处理对HRMECs的NLRP3和Pro Casp-1表达无明显影响，因此后续实验选用最低有效浓度250 LSU/L处理细胞，见图4A。细胞免疫荧光结果显示，高糖处理下，HRMECs中的NLRP3和NOX4表达都显著升高，而高糖与SDX同时处理的HRMECs中NLRP3和NOX4表达下降；Pearson相关系数统计结果都显示，高糖处理时HRMECs中NLRP3和NOX4的共定位明显增加，在额外添加SDX处理时显著下降（P＜0.05），见图4B。

5 SDX在HRMECs中减少NOX4诱导的NLRP3炎症小体活化

Figure 2.SDX inhibited high glucose（HG）-induced degradation of junction proteins in both diabetic mouse retinas and HRMECs.A：Western blot analysis and densitometry quantification of zonula occludens-1（ZO-1）in retinas；B：Western blot analysis and densitometry quantification of ZO-1 and VE-cadherin（VE-Cad）in HRMECs；C：representative images（scale bar=100 μm）and mean fluorescence density of VE-Cad in HRMECs.Mean±SEM.n=6.*P＜0.01 vs Con+NS group or Man（5.5 mmol/L glucose and 24.5 mmol/L mannitol）group；#P＜0.05 vs DM+NS group or HG（30 mmol/L glucose）group.图2 SDX在糖尿病小鼠视网膜和HRMECs中均能抑制高糖诱导的连接蛋白降解

Western blot结果显示，高糖处理使HRMECs中NOX4和NLRP3炎症小体组分的表达均增加，其下游分子IL-1β的表达也增加；敲减NOX4后以上蛋白在HRMECs中的表达都显著下降（P＜0.05），见图5A。同样，我们观察到无论是在正常糖还是高糖状态，过表达NOX4都引起了NLRP3的表达显著上升，而SDX处理降低了NOX4、NLRP3和cleaved Casp-1蛋白水平（P＜0.05），但Pro Casp-1蛋白水平始终没有统计学意义的变化，见图5B。

6 SDX在HRMECs中抑制NOX4介导的ROS生成

ROS在高糖处理下明显增加，而高糖与SDX共处理显著降低了ROS的生成（P＜0.05），见图6A、D。敲减NOX4后，ROS的生成显著降低（P＜0.05），见图6B、E。相反，过表达NOX4使HRMECs的ROS生成明显升高，而过表达NOX4后再加入SDX处理，ROS的生成显著下降（P＜0.05），见图6C、F。

7 SDX在HRMECs中抑制NOX4诱导的连接蛋白降解

在高糖处理下，HRMECs中NOX4表达升高，而ZO-1和VE-Cad都明显下降，而敲减NOX4后，ZO-1和VE-Cad都显著升高（P＜0.05），见图7A。相反，过表达NOX4无论是在正常糖还是高糖状态使ZO-1和VE-Cad表达减少，而过表达NOX4后再用SDX处理，则部分抑制了NOX4表达的同时也部分恢复了ZO-1和VE-Cad在 HRMECs中的表达（P＜0.05），见图7B。

讨 论

NLRP3炎症小体的激活与DR中内皮细胞的损伤关系密切。本研究实验结果表明，在糖尿病小鼠视网膜中，NLRP3炎症小体的成分显著升高，确证了DR小鼠视网膜的炎症反应。视网膜铺片结果显示NLRP3和血管内皮标志物GS-IB4高度共定位，提示视网膜的NLRP3升高主要是在内皮细胞中，这让我们更加确信NLRP3炎症小体的激活与DR中内皮功能的损伤及血管渗漏有关。

多个研究表明高糖刺激可以诱发内皮细胞的氧化应激和炎症反应［16］。ROS是激活NLRP3炎性小体的重要中间分子［17］。在糖尿病状态下，NOX4产生的ROS可以引起内皮损伤，使用抗氧化剂或NOX抑制剂抑制了糖尿病小鼠的视网膜渗漏［18］，提示NOX/ROS对DR的血管渗漏有负面影响。我们的研究提示NOX4/ROS可以激活NLRP3炎症小体，而抑制ROS可减轻由IL-1β引起的炎症反应［19］。我们认为在高糖刺激下，HRMECs的炎症反应至少有一部分要归咎于NOX4/ROS/NLRP3通路的激活，同时本研究也为NLRP3及其下游、NOX4等作为DR治疗的靶点提供了依据。

Figure 4.SDX inhibited high glucose（HG）-induced NLRP3 inflammsome activation in HRMECs.A：Western blot analysis and densitometry quantification of NOX4，NLRP3，procaspase-1（Pro Casp-1）and cleaved caspase-1（cleaved Casp-1）；B：representative images（scale bar=25 μm）and colocalization ratio of immunofluorescence staining of NOX4 and NLRP3.Mean±SEM.n=3.*P＜0.01 vs Man group；#P＜0.05 vs HG group.图4 在HRMECs中，SDX抑制高糖诱导的NLRP3炎症小体激活

内皮细胞是通过连接蛋白，如ZO-1和VE-Cad等相互衔接的，内皮细胞间的连接对于维持内皮通透性非常重要［20］。研究表明，NLRP3炎症小体的激活会导致内皮间连接蛋白的降解［21］。与报道一致，我们在糖尿病小鼠中观察到了ZO-1的降低，在高糖处理的HRMECs中观察到了ZO-1和VE-Cad的降低，与NLRP3的变化呈相反趋势。有研究提示IL-1β降低了血管内皮细胞之间ZO-1和claudin-5的黏附强度，导致血管通透性增加［22］，因此IL-1β也许是研究NLRP3与ZO-1等内皮细胞间连接蛋白关系的切入点。总之，NOX4/ROS/NLRP3通路的抑制对DR具有保护作用。

Figure 5.SDX inhibited NOX4-induced NLRP3 inflammsome activation in HRMECs.Western blot analysis and densitometry quantification of NOX4，NLRP3，procaspase-1（Pro Casp-1）and cleaved caspase-1（cleaved Casp-1）were shown.A：the cells were treated with 5.5 mmol/L glucose and 24.5 mmol/L mannitol（Man）+negative control siRNA（si-NC），Man+NOX4 siRNA（si-NOX4），30 mmol/L glucose（HG）+si-NC or HG+si-NOX4；B：the cells were treated with Man+control adenovirus（Ad-GFP），Man+adenovirus carrying NOX4 gene（Ad-NOX4），Man+Ad-NOX4+SDX，HG+Ad-GFP，HG+Ad-NOX4 or HG+Ad-NOX4+SDX.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs Man+si-NC group；#P＜0.05 vs HG+si-NC group；△P＜0.05 vs Man+Ad-GFP group；▲P＜0.05 vs HG+Ad-GFF group；+P＜0.05 vs HG+Ad-NOX4 group.图5 在HRMECs中，SDX抑制NOX4诱导的NLRP3炎症小体激活

研究报道减少ROS可减轻糖尿病的症状［23］；NOX家族也被视为治疗DR的靶点之一［24］。SDX既往被报导具有抑制炎症和抗氧化的作用，具体机制未阐明［25］。而我们的研究结果表明，SDX干预可抑制由高糖引起的NOX4/ROS/NLRP3通路激活，从而保护内皮间连接蛋白；动物实验也表明，SDX干预显著减少糖尿病小鼠视网膜渗漏。此外，神经节细胞在DR中降解也是损害视力的原因之一，我们在糖尿病小鼠中观察到SDX抑制了由糖尿病引起的节细胞数量下降，提示SDX不仅对HRMECs有保护作用，可能还对视网膜中其他的细胞有保护作用。因此，SDX可以被考虑用作治疗DR。但是，SDX作为糖萼保护剂是否直接作用于NOX4仍有待研究。

Figure 6.SDX inhibited NOX4-mediated ROS generation in HRMECs.The representative images and quantification of ROS generation were shown.A and D：the cells were treated with 5.5 mmol/L glucose and 24.5 mmol/L mannitol（Man），30 mmol/L glucose（HG），HG+125 LSU/L SDX（SDX125）or HG+250 LSU/L SDX（SDX250）；B and E：the cells were treated with Man+negative control siRNA（si-NC），Man+NOX4 siRNA（si-NOX4），HG+si-NC or HG+si-NOX4；C and F：the cells were treated with Man+control adenovirus（Ad-GFP），Man+adenovirus carrying NOX4 gene（Ad-NOX4），Man+Ad-NOX4+SDX，HG+Ad-GFP，HG+Ad-NOX4 or HG+Ad-NOX4+SDX.Mean±SEM.n=5.▲P＜0.05 vs Man group；&P＜0.05 vs HG group；*P＜0.05 vs Man+si-NC group；#P＜0.05 vs HG+si-NC group；$P＜0.05 vs HG+Ad-GFP group；△P＜0.05 vs HG+Ad-NOX4 group.图6 在HRMECs中，SDX抑制NOX4介导的ROS生成

综上所述，本研究发现SDX通过抑制NOX4/ROS/NLRP3通路减轻HRMECs的氧化应激反应和炎症反应，从而保护连接蛋白ZO-1和VE-Cad，以减轻DR中的微血管渗漏（图8）。本研究为SDX应用于DR治疗提供了新的证据。

Figure 7.SDX attenuated NOX4-induced damage of junction proteins in HRMECs.Western blot analysis and densitometry quantification of NOX4，ZO-1 and VE-Cad were shown.A：knockdown of NOX4；B：over-expression of NOX4.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs Man+si-NC group；#P＜0.05 vs HG+si-NC group；△P＜0.05 vs Man+Ad-GFP group；▲P＜0.05 vs HG+Ad-GFF group；&P＜0.05 vs HG+Ad-NOX4 group.图7 在HRMECs中，SDX通过抑制NOX4减少高糖对连接蛋白的损伤

Figure 8.A proposed schematic diagram of how sulodexide（SDX）protects human retinal microvascular endothelial cells（HRMECs）with high glucose stimulation.NADPH oxidase 4（NOX4）-derived reactive oxygen species（ROS）facilitate the activation of nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3（NLRP3）inflammasome and further destroy zonula occludens-1（ZO-1）and VE-cadherin（VE-Cad）after high glucose treatment.Our study indicates that SDX suppresses expression of NOX4，thus inhibiting NOX4-derived ROS and NOX4-induced NLRP3 activation.Our study also provides evidence that SDX protects ZO-1 and VE-Cad in response to glucotoxicity or NOX4 over-expression.This suggests that SDX may alleviate leakage in diabetic retinas via inhibiting NOX4/ROS/NLRP3 pathway.ASC：apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain；Casp-1：caspase-1；IL-1β：interleukin-1β.图8 SDX保护HRMECs的示意图