不同卵巢刺激方案对高龄不孕患者卵泡液氧化应激及ART结局的影响

谢广妹，杨杰，许思娟，安锦霞，倪亚莉

(甘肃省妇幼保健院生殖医学中心，兰州 730050)

近年来，随着社会经济的快速发展、竞争压力的增加以及生育年龄的推迟，不孕症发病率在逐年上升，我国女性不孕症发病率约为15%[1-2]。以体外受精-胚胎移植(IVF-ET)为主要代表的辅助生殖技术的出现与发展造福了数千万不孕症家庭[2]。正常情况下，机体的氧化和抗氧化状态保持动态平衡，当活性氧(ROS)产生过多或抗氧化能力下降时，动态平衡被打破，导致细胞出现氧化损伤，最终造成细胞功能的异常[3-4]。辅助生殖技术过程中的诸多因素都可以导致机体氧化应激的产生及ROS的增加，进而影响辅助生殖治疗结局，因此，氧化应激对辅助生殖技术和人类生育潜能的影响在近年来也越来越受到关注[5]。目前，关于高龄女性患者中IVF助孕时卵泡液中氧化应激状况及其对IVF结局影响的研究不多，且存在一定争议，与卵巢刺激方案的不同也存在一定的关系。因此，本研究旨在关注高龄女性患者不同卵巢刺激方案的卵泡液中ROS和TAC表达水平及其与辅助生殖治疗结局间的相关性。

材料和方法

一、研究对象

回顾性分析2017年1～12月在甘肃省妇幼保健院生殖医学中心行辅助生殖治疗的高龄女性患者的病历资料。纳入标准：(1)女性年龄≥35岁；(2)不孕为单纯输卵管因素；(3)男方性激素检测正常、精液正常；(4)所有患者在3个月之内未进行任何药物治疗。排除标准：(1)子宫畸形及宫腔黏连患者；(2)患者夫妇患有其他内分泌疾病。

共纳入符合标准的患者194例，按照促排卵(COH)方案不同分为短效长方案组(n=52)、拮抗剂组(n=47)、超长方案组(n=45)和高孕酮状态下促排卵(PPOS)组(n=50)。

二、研究方法

1.促排卵方案：(1)短效长方案：于前一周黄体酮中期开始肌肉注射短效GnRH-a(达必佳，辉凌，德国)0.05～0.1 mg/d进行垂体降调节至HCG注射日，降调节14～16 d达到启动标准后开始促排卵。(2)拮抗剂方案：于月经第1～3天开始启动促排卵，结合阴道B超监测卵泡生长情况和血清激素水平，当卵泡≥14 mm时开始肌肉注射拮抗剂思则凯(Baxter，德国)0.25 mg/d至HCG注射日。(3)超长方案：于月经第1～3天肌肉 注射GnRH-a 3.75 mg×2～3支，最后一支注射30 d后行B超和血清激素检测，垂体达到降调标准后开始给予外源Gn(醋酸亮丙瑞林，北京博恩特)促排卵，根据B超检测卵泡情况以及血清激素水平调整Gn剂量。(4)PPOS方案：于月经第1～3天开始使用安宫黄体酮片(浙江仙琚制药)10 mg/d和注射用尿促性素(宁波人健药业)225 U/d 至HCG扳机日。2种药物剂量在促排卵过程中保持恒量。根据卵泡直径、血清激素水平确定扳机时间。

2.资料采集及卵泡液收集：采集所有患者的年龄、不孕年限、基础内分泌等资料。取卵日早晨空腹收集卵泡液，超声引导下首先穿刺位置最低的1枚大卵泡(直径在20 mm左右)，穿刺时穿刺针尽量避开血管，适当压力抽吸，抽吸干净后，将无血液污染的卵泡液送入胚胎实验室单独放置，并标注姓名，日期等相关信息。解剖镜下卵母细胞寻找完成后，立即将卵泡液于300g离心20 min，随后取上清液分装至无菌Eppendoff 管中，置于-80℃冷冻保存。批量检测，避免反复冻融，以保证测定的可靠性和稳定性。

3.主要评价指标：记录患者行促排卵时的Gn时间、Gn总量、AMH、窦卵泡数(AFC)、获卵数、成熟卵数、受精数、卵裂数及临床妊娠率等。

4.氧化应激检测：提取中心保存的194例患者血清样本，送至甘肃省妇幼保健院临床检验中心。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组卵泡液中活性氧ROS、超氧化物歧化酶SOD、总抗氧化能力TAC、谷胱甘肽GSH以及丙二醛MDA含量。ELISA试剂盒均购自江苏酶免实业有限公司，具体步骤按试剂盒说明书操作。

三、统计学处理

结 果

一、各组患者的基本临床资料

统计结果显示，各组患者的年龄、不孕年限、LH和PRL水平均无显著性差异(P>0.05)；超长方案组FSH水平显著高于其余3组(P<0.05)，但其余3组间的FSH水平无显著差异(P>0.05)；短效长方案组和PPOS组E2水平显著高于拮抗剂组和超长方案组(P<0.05)，但短效长方案组和PPOS组、拮抗剂组和超长方案组间E2水平均无显著性差异(P>0.05)(表1)。

表1 各组患者一般情况(-±s)

注：与超长方案组比较，*P<0.05；与短效长方案组和PPOS组比较，#P<0.05

二、各组促排卵情况

组间分析结果显示：与短效长方案组相比，拮抗剂方案组、超长方案组和PPOS方案组的Gn时间显著升高(P<0.05)，AFC显著降低(P<0.05)；与拮抗剂方案相比，超长方案组的AFC显著升高(P<0.05)，而PPOS方案组的Gn时间和AFC均无显著性差异(P>0.05)；与超长方案组相比，PPOS方案组的Gn时间无显著性差异(P>0.05)，AFC显著降低(P<0.05)；各组间的Gn总量和AMH水平均无显著性差异(P>0.05)(表2)。

表2 各组患者促排卵情况比较(-±s)

注：与短效长方案组比较，*P<0.05；与拮抗剂组比较，#P<0.05；与超长方案组比较，△P<0.05

三、不同促排卵方案对卵泡液氧化应激水平的影响

氧化应激指标分析结果表明：与短效长方案组相比，拮抗剂方案组ROS、MDA含量显著升高(P<0.05)，超长方案组SOD含量显著升高(P<0.05)；与拮抗剂方案组相比，超长方案组ROS和MDA含量均显著降低，而GSH、SOD和TAC含量均显著升高(P<0.05)，PPOS方案组中仅MDA浓度显著降低(P<0.05)；与超长方案组相比，PPOS方案组仅SOD含量显著降低(P<0.05)，其余指标均无显著性差异(P>0.05)。

四、不同超促排卵方案ART结局比较

不同超促排卵方案ART各指标统计分析结果显示：与短效长方案相比，拮抗剂方案获卵数、受精率、优质胚胎率和临床妊娠率均显著降低(P<0.05)，超长方案组除卵裂率外其余指标均显著升高(P<0.05)，PPOS组获卵数显著升高，而受精率、优质胚胎率和临床妊娠率均显著降低(P<0.05)；与拮抗剂方案相比，超长方案组除卵裂率外其余指标均显著升高(P<0.05)，PPOS组仅获卵数显著升高(P<0.05)而其余指标无显著性差异；与超长方案相比，PPOS方案获卵数、卵成熟率、受精率、优质胚胎率和临床妊娠率均显著降低(P<0.05)；卵裂率在各组之间均无显著性差异(P>0.05)(表4)。

表3 不同促排卵方案之间卵泡液氧化应激水平的比较(-±s)

注：与短效长方案组比较，*P<0.05；与拮抗剂相比，#P<0.05；与超长方案组比较，△P<0.05

表4 不同促排方案之间ART结局的比较[(-±s)，%]

注：与短效长方案组比较，*P<0.05；与拮抗剂相比，#P<0.05；与超长方案组比较，△P<0.05

讨 论

随着时代的发展，女性社会角色的转换，越来越多的妇女推迟生育年龄，加上二胎政策的放开，使得就诊不孕人群日渐增多[6]。女性生育能力随着年龄的增长而下降，在辅助生殖项目中，高龄妇女妊娠率和植入率都要比年轻患者低得多[7]。目前，虽然对于女性高龄生育年龄没有确切的定义，但诸多经典的大样本流行病调查认为，35岁以上妇女卵巢的储备卵泡数目和卵母细胞质量明显下降，成为影响其妊娠结局的关键因素。随着年龄的增加，女性不孕症发生率明显增高，有文献报道，35～39岁女性不孕症发生率约为30%，40～44岁女性的不孕率高达64%[8]。因此，选择辅助生殖技术助孕的高龄不孕患者也随之增多。

促排卵的目的是应用促排卵药物使多个卵泡同步发育成熟，获得多个卵细胞，从而获得更多可供移植的胚胎，提高临床妊娠率[9]。选择个体化的刺激方案是辅助生殖技术中的重点。GnRH-a长方案、GnRH-a短方案以及拮抗剂方案是目前临床上常用的方案。陈军等[9]研究发现，卵巢窦卵泡数不同患者行上述3种超促排卵方案时获卵数、优质胚胎率均无显著性差异；拮抗剂方案临床妊娠率高于GnRH-a长方案和GnRH-a短方案，但无显著差异。孙艳兰等[10]研究发现，对子宫内膜异位症患者行不同超促排卵后，短方案组FSH水平、LH值显著高于超长方案，而窦卵泡数、Gn天数、Gn用量及获卵数均显著低于超长方案。本研究发现，短效长方案组和超长方案组的成熟卵率、受精率和优质胚胎率显著高于拮抗剂方案组；短效长方案组Gn时间显著高于其他3组，窦卵泡数均显著低于后者；短效长方案组和超长方案组的临床妊娠率显著高于拮抗剂方案和PPOS方案；各组AMH、Gn总量及卵裂率均无显著性差异。我们的研究结果和以往研究基本一致[11-12]。

氧化应激是活性氧产生过多或抗氧化能力受损而引起的一种氧化/抗氧化失衡状态[13-14]。近年来，在腹膜液、卵泡液和输卵管积水等重要的生殖微环境内都检测到ROS的存在[15-17]。氧化应激可以引起一系列女性生殖相关疾病，如子宫内膜异位症、不明原因性不孕等[18]。卵泡液内氧自由基和清除剂含量可直接影响卵母细胞的生长和发育潜力[19]。有研究表明，氧化应激可能通过诱导染色体和线粒体DNA的损伤而直接降低PCOS患者的生育能力[4]。已有研究证实，卵泡微环境中氧化和抗氧化平衡状态和卵子成熟度相关，同时，受精率和妊娠率也随着抗氧化水平的升高而增加[20-21]。此外，还有研究表明，颗粒细胞的氧化应激能够导致DNA氧化产物含量的增加，最终导致受精率和细胞质量的降低[22]。ROS的增加和抗氧化能力的减弱可引起高龄女性卵母细胞质量的降低[3]。Lai等[17]的研究也发现PCOS患者颗粒细胞中ROS水平的升高，极大地诱导了细胞凋亡，进而影响卵母细胞质量，降低了PCOS女性IVF-ET妊娠结局。本研究发现，拮抗剂方案组的ROS含量明显高于短效长方案组、超长方案组以及PPOS方案组，临床妊娠率显著低于短效长方案组和超长方案组，和PPOS方案组虽无显著性差异，但仍相对较低。这表明，高龄女性采用拮抗剂方案时，相比其他各方案，卵泡液氧化应激水平越高，ART结局较差。

研究表明，哺乳动物卵母细胞和胚胎细胞内部存在非酶性抗氧化物(维生素、半胱氨酸等)和酶性抗氧化物(SOD、GSH等)可以拮抗ROS的产生[23]。SOD能够反映机体抗氧化和氧化水平、清除体内自由基，进而避免卵细胞遭遇氧化应激的伤害[16]。Matos等[24]研究发现，高龄女性颗粒细胞中SOD水平低于正常值。我们的研究发现，高龄女性患者行不同促排卵方案时，超长方案组的抗氧化水平(SOD、TAC、GSH)显著高于拮抗剂组、短效长方案组和PPOS方案组，而且该方案下的成熟卵率、受精率，优质胚胎率和临床妊娠率也均高于拮抗剂组和PPOS方案组，表明高龄患者体内的抗氧化水平和ART结局具有一定的关联性。

总之，行不同超促排卵方案的高龄女性患者间氧化应激水平和ART结局存在差异，其中超长方案组的FSH水平、优质胚胎率、临床妊娠率均高于短效长方案组、拮抗剂组和PPOS组，前者的抗氧化水平同样高于后者。因此，我们推测，超长方案更适用于高龄女性不孕患者，可以获得较好的妊娠结局，而且妊娠结局和氧化应激水平具有一定的相关性。