海产品中邻苯二甲酸酯的检测及健康风险评估

2020-05-24胡红美李铁军徐开达孙秀梅应忠真金衍健杨承虎郭远明

中国食品学报 2020年5期

张露胡红美李铁军徐开达孙秀梅应忠真金衍健杨承虎郭远明

（浙江海洋大学海洋与渔业研究所浙江省海洋水产研究所浙江省海洋乐渔业资源可持续利用技术研究重点实验室浙江舟山316021）

邻苯二甲酸酯（phthalates，PAEs），作为添加剂在塑料、聚乙烯树脂等制造业中的大量使用及其释放使得它们在环境中普遍存在，近年来备受关注[1]。报报道，在过去的几十年里，世界PAEs 的产量从1975年的180 万t 迅速增长到2011年的800 万t[2]。大多数PAEs 不与母体基质共价结合，这使得它们的释放更加频繁[3-4]。研究表明PAEs甚至在低浓度时就能表现出内分泌干扰作用或生殖毒性[5]。欧洲食品安全局规定邻苯二甲酸二丁酯（DBP）、邻苯二甲酸丁苄酯（BBP）、DEHP、邻苯二甲酸二异癸酯（DIDP）、邻苯二甲酸二正辛酯（DNOP）每天摄入量限量分别为0.01，0.5，0.01，0.15，0.15 μg/kg，世界卫生组织规定邻苯二甲酸二甲酯（DMP）的每天摄入量不超过500 μg/kg。

PAEs 通过废水和河流输入进入海洋，目前在各类海洋生物中也均有不同程度的检出，从初级生产者（浮游生物和大型藻类）到尖吻角鲨，在食物网中并没有观察到生物放大效应[6]。Cheng 等[7]对香港市售的20 多种鱼类进行检测，PAEs 在淡水鱼和海水鱼中的含量分别为1.66～3.14 和1.57～7.10 μg/g。多数研究表明海产品中PAEs 浓度相对较低，然而，DEHP 在不同水平上均被检测到[8]。对于海产品的检测，提取和净化是关键，尤其脂肪等杂质，在前处理时与亲脂性PAEs 被共同萃取出来，在使用色谱分析方法【如气相色谱-质谱法（GC-MS）或液相色谱-质谱法（LC-MS）】之前，还需要一些额外的前处理以除去脂肪。迄今为止，常用的PAEs 前处理方法，首先采用索氏提取[9]、加速溶剂萃取[10]、超声波萃取[11-23]、微波萃取[24]等完成萃取，再通过凝胶渗透色谱[13,18-19]、固相萃取[11-12，14-17，19-21，24]、冷冻脱脂[13]、分散固相萃取（DSPE）[22，25-26]等对脂肪基质进一步净化。DSPE 是Anastassiades 在2003年推出的QuEChERS 方法中必不可少的净化步骤，因其简单、高效而在食品、沉积物、土壤样品前处理中应用[25-31]。基于实验室前期工作[29-30]，本研究提出海产品中PAEs 检测的DSPE 方法，并将该法用于舟山经济海产品的检测，同时评估人体摄入海产品中PAEs 的健康风险，以期为PAEs 的风险管控提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 7890B/5977A 气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦科技公司；Büchi R-215 旋蒸仪，瑞士步琦有限公司；EVA50A 氮吹仪，北京普立泰科仪器有限公司；SK8200GT 超声波萃取仪，上海科导超声仪器有限公司；Avanti JXN-30 series 低温超高速离心机，美国贝克曼公司。

N-丙基乙二胺（PSA，40～63 μm）、弗罗里硅土（Florisil，60～100 目）、C18（40～63 μm）、石墨化炭黑（GCB，120～400 目）、硅胶（Si，40～46 μm）、中性氧化铝（Alumina-N，100～300 目），购自上海安谱科学仪器有限公司。

PAEs 标准物质，德国Dr 公司。以正己烷为溶剂，通过逐级稀释，配制成1 000 μg/L 的混标溶液，4℃贮存。正己烷（HEX）、二氯甲烷（DCM）、乙酸乙酯（EAC）、丙酮（ACE）、异丙醇（IPA）、乙腈（ACN）、甲醇（MT）等均为HPLC 级。

1.2 仪器工作条件

1）色谱条件 HP-35MS 毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；不分流进样，进样口、传输线的温度均为260 ℃；程序升温，初始温度100℃，以10 ℃/min 升至290 ℃（保持5.0 min）；高纯He 作为载气，流量1.0 mL/min。

2）质谱条件电子轰击离子源（EI），电离能量为70 eV，离子源、四级杆温度分别为230，150℃；溶剂延迟3 min；选择离子监测，具体的定性、定量离子参考本实验室前期建立的质谱条件[30]。

1.3 试验方法

1.3.1 样品采集、制样和保存所有海产品均购自舟山水产码头，样品储存和制备参考文献[11]。具体制样时，将鱼类去鳞、去皮，取背部和腹部肌肉；甲壳类去壳、取肌肉；贝类去壳，取可食部分。将样品切成小块，高速搅碎机匀质后，-18 ℃冷冻保存。

1.3.2 样品前处理称取2.00 g 样品，置于玻璃离心管中，加入HEX∶DCM（1∶1，V/V）20 mL，涡旋3 min，超声波提取15 min，根据需要加入Cu 粉（1～3 g）超声脱硫，4 000 r/min 离心3 min，提取液经无水Na2SO4脱水，再向样品中加入HEX 20 mL，重复上述步骤，合并提取液，39 ℃旋转蒸发至干，加入2 mL HEX 溶解，转移至含200 mg GCB的玻璃离心管中，涡旋30 s，3 000 r/min 高速离心2 min，取上清液置于另一玻璃试管中，依次加入2 mL ACE、2 mL DCM、2 mL MT，重复上述涡旋离心过程，合并上清液，吹氮至干，用HEX 定容1 mL，取1 μL 进行GC-MS 分析。

1.4 健康风险评估

美国环保署（US EPA）将DEHP 归类为可能的致癌物，对DEHP 同时评估致癌风险和非致癌风险。其它PAEs 只需计算非致癌风险。本研究采用美国环保署推荐的有毒有害物质风险评价模型进行定量评估，公式如下：

式中Cseafood——海产品中PAEs 测定含量,mg/kg；EDI——居民每日暴露量，μg/（kg·d）；CR——海产品日均摄入量，g/d；BW——居民体重，本研究成人、儿童体重分别以60 kg 和15 kg计[32-33]，海产品日均摄入量分别为142.2 g/d 和50 g/d[34-35]。

式中：HQ——有毒物质非致癌风险指数，当HQ ＞1 时存在健康风险，反之风险可接受；RfD——经口暴露参考剂量，μg/（kg·d），DMP、邻苯二甲酸二乙酯（DEP）、邻苯二甲酸二异丁酯（DIBP）、DBP、BBP、DEHP 的RfD 分别为800，800，800，100，200，20 μg/（kg·d）[36]。

式中：R——致癌风险，当R＜1×10-6时无致癌风险，反之有一定的致癌风险。CSF——致癌斜率系数，DEHP 为0.014 [mg/（kgod）]-1[37]。

2 结果与讨论

2.1 萃取剂的选择

根据不同萃取剂的超声波萃取效果（图1），选用DCM 萃取2 次时，DMP、DIBP、DBP、邻苯二甲酸二己酯（DNHP）、邻苯二甲酸二环己酯（DCHP）、DNOP、邻苯二甲酸二苯酯（DPhP）、邻苯二甲酸二壬酯（DNP）的回收率较差（54%～68%）；选用HEX，DMP、DIBP、DBP、邻苯二甲酸二甲氧基乙酯（DMEP）、邻苯二甲酸二乙氧基乙基酯（DEEP）的回收率较差（48%～67%），而DNOP、DPhP、DNP 的回收率较好（75%～77%）；选用EAC，除DMP、邻苯二甲酸二-4-甲基-2-戊基酯（BMPP）、DMEP、邻苯二甲酸二正戊酯（DNPP）、DEHP 外，其它PAEs 回收率较差（47%～68%）；选用HEX∶EAC（1∶1，V/V），DMP、DBP、DPhP 回收率略差（62%～69%）；选用HEX∶DCM（1∶1，V/V），DNOP 回收率略差（68%）；同时选用HEX∶DCM（1∶1，V/V）、HEX 各萃取1 次，16 种PAEs 回收率在72%～103%，萃取效果令人满意，为本研究优选。

图1 不同的萃取剂萃取效果对比Fig.1 Comparison of extract efficiency by different extractamts

2.2 固相吸附剂的选择

脂肪和色素是干扰海产品检测的关键因素，最常用的是固相萃取和凝胶渗透色谱净化，然而这两种方法溶剂用量较大，步骤较多。而用DSPE方法净化水产品[22，25-26]中PAEs，使用PSA 作为吸附剂，对色素较多的水产品的吸附效果不佳，且仅用乙腈[22]或异丙醇[25-26]作为分散剂，检测灵敏度较差，甚至市售水产品中具有普遍检出特性的DEHP 也为未检出[25-26]。

本研究对比了200 mg 的Florisil、PSA、GCB、C18、Si、Alumina-N 等吸附剂的除杂效果（图2和图3），结果表明，各吸附剂对色素的吸附能力依次为GCB＞Florisil＞Si＞PSA＞C18＞Alumina-N。选用GCB，分散液基本无色透明，且回收率较高（73%～107%）。其它吸附剂对某些PAEs 有不同程度的吸附，如C18 对BMPP、DMEP、BBP、DCHP、DNP 略有吸附（回收率61%～66%）。PSA 对DPhP 吸附较强（回收率仅33%）。Si、Florisil 对DMEP 均有一定吸附（回收率分别为37%和66%），且净化后仍有杂质干扰DEEP 检测。最终，本研究选择GCB 作为吸附剂。

图2 不同的吸附剂对PAEs 净化效果对比Fig.2 Comparison of purifying effect of PAEs by different adsorbents

图3 不同的吸附剂净化时总离子流图Fig.3 Total ion current chromatograms purified by different adsorbents

2.3 分散剂的选择

根据文献报道，对于水产品[22，25-26]或土壤[31]，仅用单一分散剂回收率较差。对比GCB 在各种分散剂中的吸附效果（图4）。结果表明，选用HEX，仅对DMEP、DBEP、DPhP 有较强的吸附；使用ACE，对DPhP 相比吸附较弱；使用DCM，对DEEP 基本无吸附；使用MT，对DMEP、BBP、DBEP、DNOP 相比吸附较弱；而IPA、EAC、ACN 对于绝大多数PAEs 均有一定的吸附，这可能是由于不同PAEs在不同的分散剂和吸附剂间的分配系数有所不同。最终依次选用2 mL HEX、2 mL ACE、2 mL DCM、2 mL MT 作为分散剂。

图4 GCB 在不同的分散剂中对PAEs 吸附的影响Fig.4 Adsorption effect of PAEs by GCB in different dispersants

2.4 线性范围、检出限、精密度、准确度

配制质量浓度范围为1～1 000 μg/L 的PAEs混标溶液进行测定，所有PAEs 的相关系数在0.9992～0.9998 范围，具有较好的线性关系。按照3 倍信噪比，DMP、DEP、DIBP、DBP、DNPP、DNHP检出限为0.15 μg/kg，BMPP、BBP、DEHP、DCHP 为2.0 μg/kg，DBEP 为0.3 μg/kg，其它PAEs 为0.25 μg/kg。

对梅童鱼样品进行低、中、高3 个梯度水平的加标回收试验，回收率、相对标准偏差分别为73%～117%和2.8%～7.5%，分析结果准确度、精密度符合方法要求（表1）。

表1 精密度、回收试验结果（n=5）Table1 Results of test for precision and recovery（n=5）

2.5 样品分析及健康风险评估

对采集的舟山市售海产品进行检测，结果显示，∑PAEs 含量为80.0～438 μg/kg；DEHP、DEP、DMP、DBP、DIBP 在所有样品中均有检出，含量为0.49～189 μg/kg，占∑PAEs 的89%～100%。此外，从部分样品中也检出DMEP、邻苯二甲酸二丁氧基乙基酯（DBEP）、DCHP、DNP。不同种类海产品中PAEs 组分特征如图5所示，DIBP、DBP、DEHP占比最高，占∑PAEs 的83.01%～94.18%。经SPSS19.0 方差分析检验，不同海产品中PAEs 含量无显著性差异。

DEHP 具有潜在致癌性，根据1.4 节的计算公式，鱼类对成人的致癌风险指数范围为2.0×10-6（梅童鱼）～4.8×10-6（龙头鱼），均值3.4×10-6；对儿童为2.9×10-6（梅童鱼）～6.8×10-6（龙头鱼），均值4.8×10-6。甲壳类对成人致癌风险指数范围为1.3×10-6（哈氏仿对虾）～3.2×10-6（青蟹），均值2.3×10-6；对儿童为1.9×10-6（哈氏仿对虾）～4.5×10-6（青蟹），均值3.3×10-6。贝类、头足类（鱿鱼）对成人致癌风险指数分别为2.4×10-6（菲律宾蛤仔）、1.2×10-6（鱿鱼），对儿童分别为3.4×10-6（菲律宾蛤仔）、1.6×10-6（鱿鱼）。所有样品的致癌风险指数都在10-6数据级，成人风险略低于儿童。根据世界各国制定的可接受风险推荐值，一般认为致癌风险在1×10-6～1×10-4范围内是可以接受的，仍存在潜在致癌风险。对于B2 类致癌物质，常将1×10-5作为致癌风险的控制标准。本研究所有样品致癌风险虽＞1×10-6，但＜1×10-5，总体上致癌风险较小。

随后，对非致癌风险进行计算，结果见图6，成人、儿童摄入DEHP、DBP、DIBP、DEP、DMP 的非致癌风险指数为10-5～10-2数量级，均远远＜1。从单组分看，所有样品非致癌风险均可接受，对人体健康危害较小。与致癌风险相同，PAEs 对成人的非致癌风险略低于儿童。假设多组分共存时不产生协同或拮抗作用，将5 种PAEs 的非致癌风险指数简单相加作为总非致癌风险指数，成人、儿童的总非致癌风险分别为4.5×10-3～1.9×10-2（平均值1.9×10-2）和6.4×10-3～2.7×10-2（平均值为1.5×10-2），总非致癌风险也可接受，这与石凤琼等[38]报道的广东沿海海洋生物体中PAEs 健康风险基本处于同一个水平。DEHP、DBP、DIBP、DEP、DMP 的非致癌风险依次降低，其中DEHP、DBP 对非致癌风险指数的平均贡献分别为85.90%和11.44%。