草莓酵素发酵过程中代谢产物及抗氧化性的变化研究

陈小伟 程勇杰 蒋立新 崔艳丽 毛建卫，3 沙如意*

（1 浙江科技学院生化学院 浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室浙江省农业生物资源生化制造协同创新中心 杭州310023 2 浙江大学化学系 杭州310027 3 浙江工业职业技术学院 浙江绍兴312000）

自由基（Free radical）在人体内由正常代谢产生，对细胞产生危害，能够降低细胞抵抗力，引起线粒体的结构损伤，从而造成细胞老化，引起帕金森综合症，还能破坏碳水化合物、脂肪、蛋白质等结构构型，从而使人体免疫力下滑，动脉粥样硬化，形成致癌物质等[1-2]。日益加快的生活节奏，使人们的饮食、运动皆受到影响，饮食不规律，长时间不运动等都会使人体内自由基积累，从而引起免疫力降低，患病率上升。

食用植物酵素（Edible Plant Jiaosu）具有自由基清除能力，对由人体内自由基积累过多引发的各种疾病有显著的预防作用[3]。食用植物酵素不仅保留了植物原料中原有的功效成分，而且经过益生菌代谢作用，其中较难利用的活性物质被进一步降解，其次级代谢产物及部分小分子成分有利于机体的吸收与利用[4-5]。

草莓（Strawberry）为蔷薇科（Rosaceae）植物[6]，目前主要以初级加工制品，如新鲜水果和草莓干等形式投放市场，存在产品开发价值低和附加值不高等问题。如将草莓加工成富含高营养价值的草莓酵素，则有利于草莓产业的转型升级和高值化利用。研究发酵过程中代谢产物和抗氧化活性变化情况对草莓酵素发酵调控、品质控制和营养价值评价至关重要。

本文以草莓酵素为对象，研究不同发酵时间的总糖、总酸、柠檬酸、L-苹果酸、醋酸、乳酸、总酚等活性成分的变化，检测草莓酵素对3 种自由基（DPPH、羟基和ABTS）的清除效率，并考察其对还原力的影响，以期构建有关草莓酵素的综合性指标评价体系，进而为草莓酵素的精准制备和发酵控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 材料 草莓：2017年3月采于浙江湖州；发酵用糖：由实验室提供。

1.1.2 试剂 甲醇、蒽酮、福林酚（10 %）、三羟甲基氨基甲烷【（HOCH2）3CNH2】、双氧 水（H2O2）、铁氰化钾、三氯化铁，国药集团化学试剂有限公司；三氯乙酸、2，2-联氮基-双-二胺盐（ABTS）、抗坏血酸（VC），阿拉丁试剂有限公司（上海）；1，1-二苯基-2-苦苯肼（DPPH），TIC 公司。以上试剂均为分析纯级。

柠檬酸标准物、醋酸标准物、乳酸标准物，阿拉丁试剂有限公司（上海）；DL-苹果酸标准物，中国药品生物制品检定所。

1.1.3 仪器 PHS-3C 型酸度计，杭州齐威仪器有限公司；Waters e2695 液相色谱，美国Waters 公司；UV-5500 PC 型紫外分光光度计，上海元析仪器有限公司。50 L 316 L 型不锈钢发酵罐，实验室自制。

1.2 试验方法

1.2.1 草莓酵素的制备 使用常温无菌水轻轻冲洗草莓，自然沥干，切片，按草莓与糖液质量比3∶4加入无菌发酵罐中，再加入适量酵液，于室温条件下避光发酵，于发酵第10，20，30，50，75 和110天分别取样，置于8 000 r/min 条件下，离心10 min，弃沉淀物，将得到的草莓酵素上清液置于-20 ℃保存，待测。

1.2.2 总糖含量的测定 参照张晓静[7]的方法，采用蒽酮-H2SO4比色法分析不同发酵时间草莓酵素中的总糖。

1.2.3 总酸含量和pH 值的测定 总酸含量的测定：采用电位滴定法检测不同发酵时间草莓酵素的总酸含量。根据滴定样品稀释液与柠檬酸溶液消耗的NaOH 溶液量，计算样品中的总酸含量（柠檬酸当量）。

利用酸度计直接测定草莓酵素发酵液的pH。

1.2.4 特征性有机酸含量的测定 参照蒋增良等[8]的方法，采用HPLC 法检测不同发酵时间草莓酵素的有机酸含量。

待测样品的预处理：取草莓酵素样品，用1.36 g/L KH2PO4缓冲液稀释至一定的倍数，将稀释液通过孔径0.22 μm 的滤膜，透过液备用。

1.2.5 总酚含量的测定 参照蒋增良等[9]的方法，采用福林酚法检测不同发酵时间草莓酵素的总酚含量。

1.2.6 DPPH 自由基清除能力的测定 参照沙如意等[10]的方法测定。

1.2.7 羟基自由基清除能力的测定 参照裴智山等[11]和Wang 等[12]的方法测定。

1.2.8 ABTS 自由基清除能力的测定 参照杜国荣等[13]的方法测定。

1.2.9 还原力的测定 参照Yıldırım 等[14]的方法测定。

2 结果与讨论

2.1 发酵过程中总糖含量的变化

采用硫酸-蒽酮法建立总糖的标准曲线，如图1所示，相关系数R2=0.9990，说明当葡萄糖质量浓度为10～80 μg/mL 时，吸光度和浓度呈良好的线性拟合度。以糖类物质作为微生物发酵过程中的主要碳源，通过总糖含量变化分析微生物生长和代谢状况。由图2可知，在发酵的前30 d，总糖浓度呈显著下降的趋势，说明此阶段微生物的生长比较旺盛，糖类物质主要用于微生物的增殖和合成代谢。发酵至第50 天，总糖含量降到0.38 g/mL，为发酵第10 天总糖浓度的46.02%，之后，总糖含量趋于稳定并有缓慢增加的趋势。发酵至第110 天，总糖浓度相比最低点（第50 天）上升了8.07%，这可能是因为随着微生物的大量繁殖和代谢，发酵液中的总糖浓度下降，使得微生物通过分解作用利用草莓原料中的糖类物质，促进更多的糖类物质溶于发酵液中。张静雯等[15]对苹果酵素发酵过程中总糖含量进行追踪发现，发酵前15 d总糖含量下降明显，微生物迅速扩增，大量消耗糖类物质，之后总糖含量缓慢回升，微生物分解苹果，部分含糖代谢产物生成，使得酵素总糖含量升高。总糖含量的变化与微生物生长繁殖和代谢作用有极大关系，这与本研究中观察的现象一致。

图1 总糖含量标准曲线Fig.1 The standard curve of total sugar

图2 草莓酵素发酵过程中的总糖消耗量Fig.2 The consumption of total sugar in strawberry jiaosu fermentation

2.2 发酵过程中总酸含量与pH 值的变化

pH 值可以反映发酵过程的异常情况，总酸同样表明发酵过程中微生物的代谢变化情况。草莓原料中有机酸的主要组成为柠檬酸[16]。本文采用柠檬酸为对照，得到草莓酵素各发酵时间点的总酸含量的变化趋势（图3）。在草莓酵素发酵前20 d，发酵液中的总酸含量较低，维持在（15.54 ±1.25）mg/mL，呈缓慢增加的趋势，此时微量酸类物质产生可能是因微生物尚未快速生长代谢，由草莓原料汁液中有机酸渗出所致。当发酵20～30 d时，总酸含量显著增长，这主要是由于酵母菌等微生物大量繁殖，产生大量的次生代谢产物（如乳酸和醋酸等有机酸）所致。相应地，pH 值迅速下降，这与图1中总糖含量显著降低的趋势相一致。发酵第75 天，总酸含量不断累积至78.98 mg/mL，随后总酸含量轻微下降，可能是因为较低的pH 值会较大程度地影响益生菌的繁殖以及代谢，进而降低了醋酸等有机酸的积累；在发酵后期，乳酸菌等益生菌旺盛的繁殖、代谢，乳酸发酵占据主导地位，多元酸的持续降解导致总酸含量略有下调。万春美等[17]以茶糖水为碳源的发酵培养基，加入红茶菌发酵，发现在发酵过程中加入糖越多，细菌繁殖速度越快，菌落总数迅速达到最大值，然而维持时间较短。发酵30 d 后，发酵液中总糖含量显著下降造成微生物增殖速度变缓，有机酸亦可能被某些益生菌作为替代碳源被部分消耗，这也是导致总酸含量降低的另一原因。

图3 草莓酵素不同发酵时间总酸、pH 的变化Fig.3 Changes in pH value，total titratable acidity during strawberry jiaosu fermentation

2.3 发酵过程中特征有机酸含量的变化

食用植物酵素制备过程中最常见的3 种菌种主要是酵母菌、醋酸菌和乳酸菌[18]。对食用植物酵素发酵过程中醋酸和乳酸等含量的变化研究有助于了解发酵状态和发酵阶段。草莓果实中含量最高的两种有机酸是柠檬酸和L-苹果酸[16]。本文主要以柠檬酸、L-苹果酸、醋酸和乳酸为研究对象，考察草莓酵素于其发酵过程中4 种有机酸含量的变化情况。计算并绘制上述4 种有机酸的标准曲线如表1所示。可见4 种有机酸的标准曲线呈现良好的线性回归拟合度，R2均高于0.99。

测定不同发酵时间草莓酵素发酵液中4 种有机酸含量，由图4可知，整个发酵过程中，总酸含量与4 种有机酸含量的增长趋势相同，发酵110 d 后4 种有机酸总含量轻微降低。发酵前20 d，发酵液中未检测到醋酸和乳酸，柠檬酸和L-苹果酸含量仅缓慢上升，总糖含量明显下降，总酸度显著降低，这说明在发酵前期主要是酵母菌利用糖类物质生成丙酮酸、乙醇等代谢产物。发酵30 d 后，醋酸和乳酸含量快速增长，说明30 d 后醋酸菌开始利用酵母菌产生的乙醇合成醋酸，乳酸菌利用原料中溶出的L-苹果酸合成乳酸，导致L-苹果酸含量停止上升并维持在一个较为稳定的水平，而乳酸积累量有所增加。发酵后期L-苹果酸的积累量缓慢降低，可能是经由苹-乳代谢路径，乳酸菌将苹果酸转化为乳酸产物。

表1 有机酸标准曲线Table1 Standard curves of organic acids

2.4 草莓酵素发酵过程中总酚含量的变化

草莓中酚类含量与其抗氧化活性有着密切的关系[19]。从图5可以发现，在整个发酵过程中，总酚含量呈先明显增加后有所降低的变化趋势。发酵至第50 天，总酚积累量达到最高值，为1.67 mg/mL。50 d 内，特别是发酵20～30 d，总酚含量极速上升，一方面，可能是这个时间段草莓在高渗透压作用下多酚类物质大量溶出；另一方面，可能是此时草莓酵素中微生物的生长代谢较为迅速，消耗原料中的某些成分进而合成多酚类化合物或者酚类物质的相互转化所致。Dordevic等[20]以覆盆子为原料，在未添加酵母、15 ℃发酵72 h 后，总酚含量由初始的1 415.7 mg GAE/L，增到2 191 mg GAE/L；在22 ℃同条件发酵时，总酚含量达2 820 mg GAE/L。30～50 d，微生物作用下草莓酵素发酵液中多酚含量进一步提高。延长发酵时间后，微生物继续消耗糖分，液相中生成的酚类物质和原料中溶出的酚类含量趋于平衡。此外，总酚含量上升，对微生物的生长起到一定的抑制作用[21]。部分生存能力强的微生物逐渐适应总酚浓度较高的发酵液，并利用酚类物质合成其它次级代谢产物，从而导致总酚类物质含量稍微下降。

2.5 草莓酵素发酵过程中抗氧化指标评价

2.5.1 DPPH 自由基清除能力变化 随着发酵过程的进行，草莓酵素对DPPH 自由基清除率指标的影响如图6所示。发酵前75 d，草莓酵素对DPPH 自由基的清除率呈现显著增加的趋势。草莓酵素发酵75 d 时，其清除率达最高值80.96%。发酵前50 d，对DPPH 自由基的清除率呈显著上升趋势，50 d 后趋于平稳，有小幅下降，这可能与微生物对总酚的降解作用有直接的关系。相比较于发酵10 d，发酵至110 d 清除率提高了861.91%，说明较长的时间发酵有利于大幅提升草莓酵素清除DPPH 自由基的能力。此外，草莓酵素发酵过程中，发酵液对DPPH 自由基清除率与发酵液中总酚含量具有相似的变化趋势，表明清除DPPH 自由基的能力与酚酸类化合物之间有一定的相关性。在发酵第0～75 d，草莓酵素对DPPH 自由基的清除能力持续提高，之后总酚含量略微下降，其DPPH 自由基清除率亦随之略有下降。综上可知，草莓酵素中的酚类物质对DPPH 清除能力有一定的贡献。

图4 发酵过程中4 种有机酸变化图Fig.4 Changes of four organic acids in the fermentation process

图5 草莓酵素发酵过程中总酚含量的变化Fig.5 Changes of total phenolic content in the fermentation of Strawberry Jiaosu

2.5.2 羟基自由基清除能力的变化 羟基自由基是人体内常见的自由基之一，可以破坏红细胞，对DNA、细胞膜等结构造成危害[22]。不同发酵阶段的草莓酵素清除羟基自由基清除率的变化情况如图7所示。随着发酵的进行，导致草莓酵素清除羟基自由基的能力明显增强，50 d 时清除率达到最高值76.44%，而在发酵前20 d 呈现促氧化现象，草莓酵素发酵液中可能含有某些促羟基自由基氧化的物质，第20 天，促氧化与抗氧化作用基本达到平衡。发酵20 d 后抗氧化效果上升显著，50～75 d清除率趋于稳定，发酵75 d 后清除率略微下降，这可能与微生物的衰亡有关。Jayabalan R[23]研究发现，在红茶菌发酵过程中，细菌和酵母代谢产生的部分酶，极可能引起茶中成分的结构修饰，使其对氮氧化物和超氧化物自由基两者的清除能力得到增强，而对于羟基自由基，清除效果表现不佳。由此可见，对羟基自由基清除的能力因原料种类而异。目前关于草莓发酵过程中代谢产物以及清除羟基自由基的能力报道很少。郭玉华等[24]发现草莓本身对羟基自由基具有清除能力，推测发酵前期的促氧化作用很可能与原料表面带入的细菌、酵母等产生的酶有关。

图6 草莓酵素对DPPH 自由基的清除率Fig.6 The DPPH free radical scavenging ability of strawberry jiaosu

图7 草莓酵素对羟基自由基的清除率Fig.7 The hydroxyl free radical scavenging ability of strawberry jiaosu

2.5.3 ABTS 自由基清除能力的变化 除DPPH自由基外，ABTS 自由基同样可用于评估体外抗氧化活性，在生物制品抗氧化活性的判定中具有较好的应用。Floegel 等[25]通过对比DPPH、ABTS 自由基检测50 种果蔬的抗氧化能力发现，利用ABTS 自由基清除率表征的抗氧化指标更能显著体现果蔬的抗氧化水平。通常情况下，对于高富含植物色素，疏水性强的抗氧化剂，通过ABTS 测定比DPPH 方法能更好地反映各种样品中的抗氧化能力。草莓酵素对于ABTS 自由基清除率的时间-效应曲线见图8。当样品取样量为150 μL 时，随着发酵时间的延长，样品对ABTS 自由基的清除率持续上升，在发酵20～30 d 之间上升显著，发酵至50 d 时对ABTS 自由基的清除率高达98.39%，然后趋于稳定。由于发酵时间再次延长，草莓酵素的ABTS 自由基清除率逐渐上升甚至接近100%。蒋增良等[9]研究发现，葡萄酵素天然发酵过程中总酚的积累量与其抗氧化指标（ABTS 自由基清除率）之间有明显的相关性，因此推断草莓酵素所具有的良好的清除ABTS 自由基的能力可能与酚酸类物质的含量密切相关。

2.5.4 还原力的变化 还原力亦为评估体外抗氧化活性的另一重要方法。在一定范围内，还原力越大，抗氧化活性越好。图9显示不同发酵时间草莓酵素的还原力的变化。

图8 草莓酵素对ABTS 自由基的清除率Fig.8 The ABTS free radical scavenging ability of strawberry jiaosu

图9 发酵过程中还原力的变化Fig.9 Changes in reducing power during fermentation

如图9所示，在发酵的前30 d，还原力上升较为明显，30 d 后保持缓慢上升。整个发酵过程中，还原力的增长呈现“先快后慢”的变化趋势，这与上述3 种抗氧化指标的变化趋势均有一定相似之处。在取样量为75 μL，发酵110 d 时还原力达到0.78。然而，在整个发酵过程中，还原力与其余3种抗氧化指标仍存有一定的差别。还原力是一个综合性抗氧化评价指标，与多种抗氧化机制有关，包括过多金属离子型的催化剂、已结合自由基的清除、过氧化物的分解反应等[26]。

2.6 主成分分析

草莓酵素发酵过程中，发酵液中各种代谢产物，如总酸、总酚、醋酸、总糖、柠檬酸、L-苹果酸、乳酸等含量，可能与各抗氧化指标性能有内在联系，然而各种活性物成分含量与各抗氧化指标变化趋势并不完全一致。为了综合考虑各组分和指标对不同发酵时间草莓酵素品质和功效的影响，采用主成分分析法建立草莓酵素的综合评价指标。

首先，对发酵过程中各成分与抗氧化指标进行相关性分析。发酵过程中各参数相关性见表2。草莓酵素的4 种抗氧化指标之间具有显著的正相关性（P＜0.01），且与总酚和总酸的积累量之间也有显著的正相关性（P＜0.01），说明草莓酵素中所含酚酸类物质和有机酸等均有一定的抗氧化功能。其中柠檬酸和L-苹果酸与抗氧化评价指标之间存在极显著的相关性（P＜0.01）。总糖和pH 值与其它参数均呈现负相关，这可能是因为发酵过程中益生菌消耗糖类物质，代谢积累酸类物质等有关。

表2 发酵过程中各参数相关性Table2 Correlation of parameters during fermentation

草莓酵素发酵过程代谢产物种类多，而且比较复杂。为了更加清晰地揭示各代谢产物与各抗氧化指标之间联系，采用主成分分析法（PCA）对上述相关指标进行分析。以特征值为依据，依次提取第1 主成分及第2 主成分（两者贡献率分别达到94.98%和3.31%）。主成分分析所得载荷图如图10所示，各指标间的距离很好地反映了彼此的相关性程度。总糖与pH 在第1 和第2 主成分中均为负值，相距较近。其它检测参数则位于载荷图中的第1 象限，各指标的第1 和第2 主成分系数均数值较大，且彼此间相距不远，从而表明这10 个参数均存在显著的相关性，验证了之前的相关性分析结果。

发酵过程中草莓酵素的主成分样品得分图见图11。发酵第10 天和第20 天第1 主成分与第30，50，75，110 天位置相聚较远，说明它们之间的性质差别较大，发酵10 d 与50 d，发酵20 d 和30 d，第2 主成分相差不大，说明两者间的主要差别在第1 主成分。发酵75 d 后第1 主成分与前50 d无显著差异，不过第2 主成分得分明显提高。依据各发酵时间的主成分得分不同，将不同发酵时间的草莓酵素样品分为3 个阶段。以主成分分析法为基础，建立草莓酵素的综合评价指数体系（Comprehensive evaluation index，CEI）。按照公式（1）计算，求得CEI 值。

图10 主成分分析的载荷图Fig.10 Loading diagram of principal component analysis

图11 主成分样品得分图Fig.11 Main component sample score chart

不同发酵时间的草莓酵素样品的综合评价指标见图12。发酵第10 天CEI 值最低，发酵20～30 d 综合评价值显著提高，发酵30 d 后CEI 值趋于稳定，发酵第75 天CEI 值最高，发酵至110 d CEI值轻微下降，此作为草莓酵素前发酵结束的依据，为后续流加碳源、接种菌液的时间点判断提供可靠的理论支撑。

3 结论

通过分析草莓酵素发酵过程中总糖、总酸、pH、4 种有机酸、总酚含量以及4 种抗氧化指标，结果表明，草莓酵素发酵过程主要可分为3 个阶段，分别是发酵初期（20 d 前）、发酵中期（20～30 d）、发酵后期（30～75 d）。发酵初期，糖类物质消耗不大，总酸未明显增强，这个阶段基本不含乳酸和醋酸，清除DPPH 自由基、羟基自由基和ABTS 自由基的能力均无明显变化，可知在此阶段主要是微生物菌群的适应期，仅有部分酵母菌代谢作用。发酵中期总糖含量迅速下降，总酸浓度上升，有机酸物质开始大量产生，乳酸菌和醋酸菌分别开始利用L-苹果酸和酵母产生的乙醇等物质合成乳酸和醋酸，草莓酵素中的总酚含量呈急剧增长的趋势，相应地，显著提升了抗氧化活性。发酵后期，总糖、总酚和柠檬酸、L-苹果酸、醋酸、乳酸含量趋于稳定，总糖的缓慢上升与酚类含量的轻微下降均是微生物消亡和适应的结果。采用主成分分析法对草莓酵素的各变量进行综合评价，发现草莓酵素的CEI 值在发酵30 d 变化较为稳定，发酵第75 天综合得分最高，可作为草莓酵素前发酵结束的依据，为后续流加碳源、接种菌液的时间点判断提供理论支持。

图12 草莓酵素综合评价指标Fig.12 Comprehensive evaluation index of strawberry jiaosu