转谷氨酰胺酶改性对明胶耐酶解性的影响

朱雨辰 张单单 王少甲 袁英髦 曹雁平*

（1 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心 北京工商大学 北京100048 2 北京市食品添加剂工程技术研究中心 北京工商大学 北京100048 3 北京工商大学 北京100048）

明胶是动物胶原蛋白在酸、碱、酶或高温等条件下形成的变性产物，因具有优良的持水性、分散稳定性和成膜性[1]，故可以作为增稠剂、澄清剂等添加于食品中改善食品品质。此外，明胶还具有凝胶性，可以作为包埋风味剂、糖及其它配合物的载体，被广泛应用于食品工业中[2-3]。随着明胶应用范围的不断扩大，其缺点逐渐显现。由于明胶的本质是蛋白质，因此存在机械强度小，易受细菌污染变质，易被蛋白酶酶解等缺点，这极大地限制了明胶的使用范围[4]。

通过对明胶的活性侧链进行修饰，获得改性明胶，可以明显改善明胶的理化性质。常见的改性方式主要有物理改性、化学改性和酶法改性[5-6]。然而，物理改性的改性速度慢，均一性差，实施较困难，导致其实际应用受到很大限制[7]；而化学改性的成本高，部分交联剂有毒性，不能用于食品工业中[8]。酶法改性因具有安全性高、可食用等优点，故成为研究的重点。常用酶主要有转谷氨酰胺酶、过氧化酶、酪氨酸酶、多酚氧化酶等，其作用机制为催化蛋白质形成分子内或分子间交联[9]，对蛋白质进行改性。其中，转谷氨酰胺酶的来源丰富，价格便宜，被广泛应用于食品加工领域[10-11]。丁克毅等[12-14]对转谷氨酰胺酶改性明胶的物理性质做了系统性研究，研究发现改性明胶薄膜的抗张强度和韧性显著提高，水溶性和吸水性则显著降低。姜燕等[15]研究发现，改性明胶膜的抗拉强度、断裂伸长率和表面疏水性都得到显著提高，总可溶性物和水分含量显著降低，而透光率变化不大。现阶段的研究主要关注改性明胶的物理性质，对其耐酶解性关注较少。

本研究以转谷氨酰胺酶改性明胶的耐酶解性为关注点，通过单因素试验和均匀设计试验研究不同改性条件对改性明胶耐酶解性的影响，并利用偏最小二乘法建立改性明胶耐酶解性预测模型，确定改性明胶的最优制备条件，为明胶材料控制释放理论研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

明胶、十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、乙酸丁酯、甘氨酸和磷酸二氢钾均为分析纯级，国药集团化学试剂有限公司；转谷氨酰胺酶（食品级），泰兴市一鸣生物制品有限公司；木瓜蛋白酶（活力4.96×105U/g），美国Sigma 公司；茚三酮（分析纯），西陇化工有限公司；D-果糖（分析纯），北京奥博星生物技术有限公司；乙醇（分析纯），北京化工厂。

CP-214 电子分析天平，上海市奥豪斯仪器有限公司；FE20 型pH 计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；UVmini-1240 型紫外-可见分光光度计，日本岛津公司；Kjeltec 8400 半自动凯氏定氮仪，德国福斯公司；DC-2006 型低温恒温水浴锅，浙江宁波新芝生物科技股份有限公司；DF-101S 型集热式恒温加热磁力搅拌器，河南省巩义市予华有限责任公司。

1.2 试验方法

1.2.1 改性明胶球的制备 本课题组前期研究[4]表明，明胶溶液质量分数为20%时，制得的明胶球黏度和硬度均适中，成球性好。本试验中明胶质量分数为20%。具体制备方法如下：将一定量明胶在60°C 下完全溶解于不同pH 值的磷酸缓冲溶液中，使明胶溶液的质量分数为20%。在不同反应温度下，向明胶溶液中缓慢滴加不同浓度的转谷氨酰胺酶溶液（1 mL），反应不同时间，反应后冷却到室温，获得明胶-转谷氨酰胺酶混合溶液。将该混合溶液缓慢滴加到经磁力搅拌器不断搅拌的冷藏的醋酸丁酯溶液中，获得凝胶球，通过调节磁力搅拌器转速，使凝胶球大小为（4±1）mm。制得的改性明胶球经超纯水清洗后，储存于4°C 下，待测。经相同处理的未改性明胶球作为对照组。

1.2.2 改性明胶耐酶解性单因素试验设计 以木瓜蛋白酶处理改性明胶的水解度为耐酶解性指标，分别研究转谷氨酰胺酶质量浓度（0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 g/L）、改性pH 值（5.0，6.0，7.0，8.0，9.0）、改性温度（40，45，50，55，60 ℃）和改性时间（10，20，30，40，50 min）对改性明胶耐酶解性的影响。

1.2.3 改性明胶耐酶解性均匀试验设计 根据上述单因素试验结果，以转谷氨酰胺酶浓度、改性pH 值、改性温度和改性时间为影响因素，做4 因素5 水平的均匀试验，分析各改性因素对改性明胶水解度的影响。利用偏最小二乘回归法处理数据，得到改性明胶水解度的预测模型，确定转谷氨酰胺酶改性明胶的最佳制备条件。采用DPSv15.10（杭州睿丰信息技术有限公司）软件进行均匀试验设计，见表1。

表1 均匀试验设计Table1 Uniform experimental design

1.2.4 改性明胶水解度的测定 取200 mL 磷酸缓冲溶液（pH 7.0），加入2 g 木瓜蛋白酶，完全溶解后加入明胶球5 g，置于恒温振荡器中40°C 下加热，每30 min 取样1 次，共取样5 次。取样后立刻用沸水浴加热5 min，使木瓜蛋白酶失活。采用茚三酮法测定样品中的氨基氮的含量，凯氏定氮法测定样品中总氮的含量。明胶的水解度计算公式如下：

式中，Ah——样品中氨基氮含量（μg）；A0——明胶中固有的氨基氮含量（μg）；Az——明胶中总氮含量（μg）。

2 结果与讨论

2.1 转谷氨酰胺酶浓度对改性明胶耐酶解性的影响

在改性pH 6，改性温度40°C，改性时间30 min 条件下，考察转谷氨酰胺酶浓度对改性明胶耐酶解性的影响。

图1结果显示，当转谷氨酰胺酶质量浓度小于0.20 g/L 时，改性明胶的水解度随着转谷氨酰胺酶浓度的增加而降低，与未改性明胶相比，改性明胶的耐酶解能力显著提高。这可能是由于转谷氨酰胺酶与明胶蛋白的赖氨酸和谷氨酰胺共价交联，导致大分子链段数目增多，从而阻碍木瓜蛋白酶对改性明胶的水解，导致水解度降低。当转谷氨酰胺酶质量浓度大于0.20 g/L 后，随着转谷氨酰胺酶浓度的增加，水解度反而有升高的趋势。这可能是因为酶浓度较高时，交联反应速率瞬间加快，蛋白质分子表面的作用位点被迅速占据，降低了其与周围其它蛋白质分子进行交联的几率，从而导致分子间交联要少[16]。当转谷氨酰胺酶质量浓度为0.20 g/L 时，改性明胶的耐酶解性最好。

2.2 改性pH 值对改性明胶耐酶解性的影响

转谷氨酰胺酶的活性受反应环境pH 值的影响，而酶活又直接影响转谷氨酰胺酶对明胶的改性程度。本研究在改性温度50°C，改性时间30 min 条件下，考察不同改性pH 值对改性明胶耐酶解性的影响。

图2结果显示，随着改性pH 值的增大，改性明胶的水解度呈现先减小后增大的趋势，在pH6.0 和7.0 时水解度较低。转谷氨酰胺酶的最适pH 值为6.0，在适宜pH 值附近，转谷氨酰胺酶的分子链充分舒展，与明胶的接触面积增大，有利于其对明胶进行改性，导致改性明胶的水解度降低，耐酶解性升高[17]；然而，pH 值过高或过低时，转谷氨酰胺酶的活性基团变性致酶失活，不利于对明胶的改性，导致改性明胶的水解度增加，耐酶解性降低[18]。此外，pH 值还通过影响明胶的溶解度，影响转谷氨酰胺酶与明胶的接触机会，从而影响改性明胶的水解度[19]。在转谷氨酰胺酶的最适pH值，即pH 6 时，转谷氨酰胺酶对明胶的改性最完全，改性明胶的耐酶解性最好。

图1 转谷氨酰胺酶浓度对改性明胶耐酶解性的影响Fig.1 The effect of transglutaminase concentration on hydrolysis ratio of modified gelatin

图2 改性pH 值对改性明胶耐酶解性的影响Fig.2 The effect of pH value on hydrolysis ratio of modified gelatin

2.3 改性温度对改性明胶耐酶解性影响

除pH 值外，酶的活性还受温度的影响。在转谷氨酰胺酶质量浓度0.20 g/L、改性pH 值6.0、改性时间30 min 条件下考察不同改性温度对改性明胶耐酶解性的影响，结果见图3。

由图3可知，改性明胶的水解度随着改性温度的增加而降低。其中，当改性温度为45°C 时，改性明胶的水解度最低，随后水解度逐渐升高。然而，这一温度与转谷氨酰胺酶的最适温度（40°C）间存在一定的差距。这可能是因为45°C 不是转谷氨酰胺酶的最适温度，此时转谷氨酰胺酶对明胶的改性更有利于其耐酶解性；随着反应温度的持续升高，转谷氨酰胺酶的酶活逐渐降低，对明胶的改性不完全，导致水解度逐渐增大[20]。改性温度为45°C 时，改性明胶的耐酶解性最好。

2.4 改性时间对改性明胶耐酶解性的影响

在转谷氨酰胺酶质量浓度0.20 g/L、改性pH值6.0、改性温度50°C 条件下，考察不同改性时间对改性明胶耐酶解性的影响，其结果如图4所示。

图3 改性温度对改性明胶耐酶解性影响Fig.3 The effect of temperature on hydrolysis ratio of modified gelatin

由图4可知，随着改性时间的延长水解度先降低再升高，改性时间30 min 时水解度达到最低。延长反应时间有利于转谷氨酰胺酶与底物充分接触，使转谷氨酰胺酶与明胶的赖氨酸和谷氨酰胺发生交联[21-22]，说明增加改性时间有利于降低改性明胶的水解度，提高改性明胶的耐酶解性。然而，持续增加改性时间，导致水解度升高，这可能与长时间高温处理导致转谷氨酰胺酶变性有关。改性时间为30 min 时，改性明胶的耐酶解性最好。

图4 改性时间对改性明胶耐酶解性影响Fig.4 The effect of time on hydrolysis ratio of modified gelatin

2.5 均匀试验结果

根据上述单因素试验结果，选择转谷氨酰胺酶浓度、改性pH 值、改性温度和改性时间做4 因素5 水平的均匀试验。不同条件下水解度的测定结果见表2。

表2 均匀试验结果Table2 Results of uniform experimental design

采用偏最小二乘回归分析法对试验结果进行分析。以转谷氨酰胺酶浓度、改性pH 值、改性温度和改性时间为自变量，水解度为因变量，利用DPSv15.10 数据处理系统软件建立改性明胶水解度预测模型：

y=9.9007241+190.453407x1-0.093988x2-0.623217 x3+ 0.008483 x4- 67343.284524 x12+0.001863 x22+0.108433x32-0.000006x42+3.276903x1x2-10.521066x1x3- 2.454853x1x4- 0.014831x2x3-0.000078x2x4-0.000671x3x4

所建立模型的R2为0.9505，说明该模型拟合度较好，方程在给定的试验范围内有较高的可信度。根据偏最小二乘法回归系数分析各因素对水解度的影响程度为：x1（转谷氨酰胺酶浓度）＞x4（改性时间）＞x2（改性pH 值）＞x3（改性温度）。为了进一步验证模型的可信度，根据模型给出的最优制备条件（转谷氨酰胺酶的质量浓度0.20 g/L、改性pH 值6.0、改性温度44°C，改性时间35 min），对模型预测的水解度与实际测得的水解度进行对比，结果见表3。模型预测的水解度和实际获得的水解度之间相对误差较小，说明通过偏最小二乘法回归所建立的模型可信度高。

表3 最优制备条件下预测水解度与实测水解度Table3 Predicted and experimental hydrolysis ratios under the optimal indexes

3 结论

采用转谷氨酰胺酶改性明胶可以显著提高明胶的耐酶解性。改性明胶的耐酶解性受转谷氨酰胺酶浓度、改性pH 值、改性温度、改性时间等多种因素的影响。通过均匀试验优化得到最优的改性条件为：转谷氨酰胺酶质量浓度为0.20 g/L，改性pH 6.0，改性温度44°C，改性时间35 min。所建立的模型预测改性明胶在经木瓜蛋白酶处理60 min 后预测水解度为4.89%，实测水解度为5.08%，相对误差为3.74%，说明所建立模型可信度高。本研究结果表明通过转谷氨酰胺酶改性可以显著提高明胶的耐酶解性，然而转谷氨酰胺酶与明胶之间的作用机理及产物结构仍不明确，需进一步研究。