鱼腥草挥发油抗氧化作用的研究

罗秋水 谢 升 汤凯洁 熊建华 杜 娟

(江西农业大学食品科学与工程学院，南昌 330045)

鱼腥草(HouttuyniaecordataThunb)，又名紫蕺，野花麦，折耳根等，属三白草科蕺菜属，茎呈扁圆柱形，叶片卷折皱缩，搓碎有鱼腥气味，多分布于长江流域和南方省区[1]。鱼腥草富含蛋白质、油脂、维生素等营养成分，还含有钙、磷、锰、钠、钾等矿物素，同时具有能清热解毒、消肿疗疮、利尿除湿、清热止痢、健胃消食等功效。现代药理实验表明，具有抗菌、抗病毒、提高机体免疫力、利尿等作用，是国家卫生部确定为“既是食品，又是药品”的资源之一[2]。

大量研究表明，药食两用的植物提取物均有不同程度的抗氧化作用[3]，而目前对鱼腥草的研究更多集中于有效成分的提取和鉴定，对鱼腥草挥发油的抗氧化作用研究及应用尚处于完善阶段[4-6]。本实验先选取了较为常用的DPPH·法和邻二氮菲-Fe2+分光光度法来评定鱼腥草挥发油的体外抗氧化活性，再以过氧化值为指标，采用Schaal烘箱法，评定鱼腥草挥发油对五种食用油的抗氧化效果，旨在为鱼腥草作为一种天然抗氧化剂及其综合利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料与设备

鱼腥草：江西农业大学校园内；猪油、花生油、大豆油、菜籽油、葵花籽油：市售；抗坏血酸、草酸、硫酸亚铁、邻二氮菲、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、H2O2、硫代硫酸钠、无水碳酸钠、重铬酸钾、碘化钾、可溶性淀粉、冰乙酸、三氯甲烷均为分析纯；SB-3200DTD超声波清洗机；LD4-20 低速离心机；UV-9100 紫外可见分光光度计；RE-52A 型旋转蒸发器；GZX-9246MBE电热鼓风干燥箱。

1.2 实验方法

1.2.1 鱼腥草挥发油的制备

将鱼腥草清除黄叶、洗净，分离茎、叶，烘干粉碎后放入干燥器中备用。分别称取一定量茎、叶样品粉末，用70%的乙醇溶液按料液比1∶50对样品进行水浴提取，提取时间为2 h、提取温度为60 ℃，室温下静置10 min后，离心15 min，转速4 000 r/min。过滤取上清液进行旋转蒸发、浓缩，经乙醚和石油醚萃取后干燥，即得到鱼腥草挥发油。

1.2.2 鱼腥草挥发油不同浓度的配制

准确称取0.25 g鱼腥草挥发油，用无水乙醇定容至25 mL容量瓶中，得10 mg/mL鱼腥草挥发油乙醇溶液，并以此为基准，用无水乙醇稀释得到200、400、600、800、1 000、1 200 μg/mL鱼腥草挥发油乙醇溶液浓度系列，保存备用。

1.2.3 抗坏血酸不同浓度的配制

准确称取0.25 g抗坏血酸，分别用超纯水及2%草酸溶液定容至25 mL容量瓶中，得10 mg/mL抗坏血酸水溶液及草酸溶液，并以此为基准，用超纯水及2%草酸溶液稀释得到200、400、600、800、1 000、1 200 μg/mL抗坏血酸水溶液及草酸溶液浓度系列，存于避光处备用。

1.2.4 对羟基自由基(·OH)的清除作用

准确称取0.25 g邻二氮菲，用无水乙醇定容至250 mL，得到5 mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液；取0.19 g硫酸亚铁晶体，蒸馏水定容至250 mL，得到5 mmol/L硫酸亚铁溶液；取19 mL 0.2 mol/L的NaH2PO4溶液和81 mL 0.2 mol/L的 Na2HPO4溶液，充分混合得到pH=7.4的0.2 mol/L磷酸缓冲溶液。

将配备好的鱼腥草挥发油乙醇溶液、抗坏血酸水溶液系列溶液及相应试剂按表1依次添加，混匀后37 ℃水浴60 min，分别在536 nm处测吸光值，平行测定2次，结果取平均值，按公式计算清除率：

清除率=[A(样)-A(损)/A(未)-A(损)]×100%

式中：A(损)为未添加样品清除羟自由基所得损伤管的吸光值；A(未)为用蒸馏水代替损伤管中的双氧水、未发生反应所得未损伤管的吸光值。

表1 羟基自由基实验加样表

1.2.5 对1,1-二苯基-2-苯基自由基(DPPH·)的清除作用

准确称取DPPH·10 mg，用无水乙醇定容至100 mL容量瓶，得10% DPPH·无水乙醇溶液；再取10% DPPH·无水乙醇溶液5 mL，稀释成1% DPPH·无水乙醇溶液，存于避光处备用。

将配备好的鱼腥草挥发油乙醇溶液、抗坏血酸草酸溶液系列溶液及相应试剂按表2依次添加，反应10 min后分别于517 nm处测定吸光值。重复测定2次，结果取平均值，按公式计算自由基清除率：

清除率=[1-(Ai-Aj)/ (A-A0)] ×100%

表2 DPPH·实验加样表

1.2.6 油脂加速氧化实验

采用Schaal烘箱法强制加速氧化[7]，将一定量的样品、抗坏血酸或混合物加入50 g油样混匀，置于100 mL烧杯中，敞口放入63 ℃的烘箱中恒温保存，每12 h搅拌一次，并变换位置，每24 h测定一次各油样的过氧化值，每个样品平行测定2次，结果取平均值。

1.2.7 过氧化值的测定

过氧化值是常用来表示油脂被氧化程度的一种指标，过氧化值越大，说明油脂被氧化的程度越大。本实验按GB 5009.227—2016测定过氧化值，用过氧化物相当于碘的质量分数表示过氧化值，基本操作：称取试样2～3 g，置于250 mL碘量瓶中，加入30 mL三氯甲烷-冰乙酸混合液，使试样完全溶解，准确加入1.00 mL饱和碘化钾溶液，塞紧瓶盖，轻轻振摇0.5 min，在暗处放置3 min，取出，加100 mL水，摇匀后立即用硫代硫酸钠标准溶液滴定析出的碘，滴定至淡黄色时，加1 mL淀粉指示剂，继续滴定并振摇至溶液蓝色消失为终点，同时进行空白实验。

2 结果与分析

2.1鱼腥草挥发油对羟基自由基的清除作用

邻二氮菲-Fe2+水溶液中的Fe2+经Fenton反应：Fe2++H2O2→ Fe3++OH-+OH·可产生羟基自由基，而氮菲-Fe2+水溶液被羟自由基氧化为邻二氮菲-Fe3+后，其536 nm处最大吸收峰消失，由此可通过比较536 nm处溶液吸光值的变化来反映对羟基自由基的清除作用[8]，清除率越大，说明清除自由基能力越强。

由图1可知，鱼腥草挥发油以及抗坏血酸对羟基自由基的清除作用均随着质量浓度的增加逐渐增大，但抗坏血酸水溶液对羟基自由基的清除作用要优于鱼腥草挥发油。当浓度在200～800 μg/mL范围内，二者对羟基自由基清除作用均呈现剂量～效应关系，浓度越高，清除率越大，并接近线性相关。当质量浓度在800～1 200 μg/mL时，随着浓度升高清除率依旧上升，但整体趋于平缓；在1 200 μg/mL时，抗坏血酸水溶液对羟基自由基清除率达到76.05%，鱼腥草挥发油的清除率达到62.72%。

图1 鱼腥草挥发油对羟基自由基的清除作用

2.2 鱼腥草挥发油对DPPH·的清除作用

DPPH·是一种稳定的有机自由基，其溶液具有特征的紫红色团吸收峰，当存在自由基清除剂时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其所接受的电子数成定量关系，因而可用分光光度法进行定量分析[9]。

由图2可知，质量浓度在200～1 200 μg/mL时，鱼腥草挥发油对DPPH·的清除作用随着质量浓度的增加逐渐增大；而抗坏血酸草酸溶液浓度在200～1 200 μg/mL范围内时，清除率在92%上下浮动。由此可见，在1 200 μg/mL时，抗坏血酸草酸溶液对DPPH·的清除率达到93.86%，鱼腥草挥发油的清除率达到72.43%。

图2 鱼腥草挥发油对DPPH·的清除作用

2.3 不同部位及混合鱼腥草挥发油对大豆油的抗氧化作用

将油样质量0.6%的茎部、叶部鱼腥草挥发油分别加入大豆油中，进行氧化实验，同时做空白对照，测定各油样的过氧化值，结果如图3所示。

图3 不同部位及混合鱼腥草挥发油对大豆油的抗氧化作用

由图3可知，随着实验时间的增加，各实验油样的过氧化值均呈现增大趋势；其中添加了混合鱼腥草挥发油的油样过氧化值最低，其次为叶部，然后是茎部，且都比空白样品的低。由此可知，叶部鱼腥草挥发油抗氧化效果要比茎部的好。

2.4 鱼腥草挥发油对5种食用油的抗氧化作用

将油样质量0.6%的鱼腥草挥发油分别加入猪油、花生油、大豆油、葵花籽油和菜籽油中，进行氧化实验，同时做空白对照，测定各油样的过氧化值，结果表明各油样随着实验时间的增加，其过氧化值均有一定程度增大，添加了鱼腥草挥发油的油样的过氧化值，均比空白油样要低，说明鱼腥草挥发油对5种食用油均具有一定抗氧化的作用；5种油样在相同环境下的氧化速度有所不同，其中以猪油的氧化速度最慢，花生油的氧化速度最快。基于对大豆油的抗氧化效果相对明显和稳定，后续实验以大豆油作为对象进行研究。

2.5 不同剂量鱼腥草挥发油对大豆油的抗氧化作用

将油样质量0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的鱼腥草挥发油分别加入大豆油中，进行氧化实验，同时做空白对照，测定各油样的过氧化值，结果如图4所示。

图4 不同剂量鱼腥草挥发油对大豆油的抗氧化作用

由图4可知，随着实验时间的增加，添加了不同剂量鱼腥草挥发油的油样过氧化值呈现增大趋势，且均比空白油样要低；随着鱼腥草挥发油添加剂量的增大，相应油样过氧化值减小，说明在以上剂量范围内，鱼腥草挥发油对大豆油的抗氧化作用具有剂量和效应关系，剂量越高，抗氧化效果越好。

2.6 鱼腥草挥发油与抗坏血酸对大豆油的抗氧化作用

将油样质量0.6%的鱼腥草挥发油、抗坏血酸和两者等比混合分别加入大豆油中，进行氧化实验，做空白对照，测定各油样的过氧化值，结果如图5所示。

由图5可知，随着实验时间的增加，各实验油样的过氧化值均呈现增大趋势，添加抗坏血酸的油样过氧化值比鱼腥草挥发油的更低，抗坏血酸、鱼腥草挥发油等比混合的最低；由此可知，抗坏血酸、鱼腥草挥发油等比混合抗氧化效果最好，其次是抗坏血酸和鱼腥草挥发油，可能的原因是抗坏血酸、鱼腥草挥发油混合呈现协同增效作用，具有更好的抗氧化作用。

图5 鱼腥草挥发油与抗坏血酸对大豆油的抗氧化作用

3 结论

鱼腥草挥发油在200～1 200 μg/mL质量浓度范围内，随着质量浓度的增加，对羟基和DPPH·两种自由基的清除作用均有增强，其中鱼腥草挥发油的质量浓度为1 200 μg/mL时，对羟基自由基清除率达到62.72%，对1,1-二苯基-2-苯基自由基清除率达到72.43%。鱼腥草叶部挥发油对大豆油的抗氧化效果优于茎部；鱼腥草挥发油对5种食用油均具有一定的抗氧化作用；5种油样在相同环境下的氧化速度有所不同，其中以猪油的氧化速度最慢，花生油的氧化速度最快；在一定剂量范围内，鱼腥草挥发油对大豆油的抗氧化作用具有剂量～效应关系，剂量越高，抗氧化效果越好；鱼腥草挥发油对大豆油的抗氧化作用弱于抗坏血酸，而两者复配对大豆油的抗氧化性具有协同增效作用。综上所述，鱼腥草确实可以作为一种效果较好的天然抗氧化剂。