希瓦氏菌群体感应的研究进展

阎 俊，赵 勇,3，谢 晶,3,4

(1.上海海洋大学 食品学院，上海 201306；2.上海海洋大学 农业农村部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室，上海 201306；3.上海海洋大学 食品科学与工程国家级实验教学示范中心，上海 201306；4.上海海洋大学 上海冷链装备性能与节能评价专业技术服务平台，上海 201306)

水产品作为优质动物蛋白的重要来源，因具有低热量、低脂肪和高蛋白特点而深受广大消费者的青睐，是人类食谱中重要组成部分。截至2016年底，全国水产品总产量达6 901.25万t，其中海水产品产量达3 490.15万t，占总产量的50.57%[1]。由于水产品中肌肉组织所具有的水份含量、不饱和脂肪酸及可溶性蛋白质含量较高，其在贮藏过程中极易发生腐败变质。据统计，我国每年因腐败变质而损失的海产品数量约占总产量的1/3[2]。水产品的腐败变质原因较为复杂，微生物的活动是导致其腐败变质的主要原因。通过对水产品的腐败现象进行研究发现:微生物的致腐能力存在明显差异。随着贮藏时间的延长，大量繁殖并导致腐败的微生物被称为优势腐败菌[3]。

希瓦氏菌(Shewanellaspp)属于革兰氏阴性菌，作为低温贮藏条件下常见的腐败微生物[4]，具有较强的致腐活性[5-6]，能产生硫化氨、氨以及胺类化合物等，同时还能够还原氧化三甲胺变成三甲胺，从而产生腐败和腥臭味儿；且易黏附于食品及容器表面，形成生物被膜[7]，使食品腐败加剧。希瓦氏菌是冷藏海产品中的优势腐败菌，其数量已经成为评价冷藏海产品质量优劣的重要指标[8]。

目前研究发现:从腐败海产品中分离的希瓦氏菌腐败特性受到群体感应(quorum sensing，QS)现象的影响[9-10]，因此研究有关QS对水产品的保鲜作用有着重要意义。本文中，笔者聚焦希瓦氏菌QS，较为系统地综述了希瓦氏菌QS与其致腐性之间的关系，拟从QS角度出发,以期为水产品保鲜提供新的思路。

1 群体感应系统

群体感应(QS)现象被首次发现于海洋中的费氏弧菌(Vibriofischeri)中[11]，经长期研究发现:这种现象普遍存在于各种细菌中，细菌间通过化学信号分子进行信息传递。群体感应系统由信号分子、感应分子以及下游调控蛋白组成。当细菌感受到自身或周围菌体密度或环境发生改变时，细菌会分泌一种被称为自诱导物(autoinducers，AIs)的信号分子，当信号分子达到一定阈值后，会激活靶基因表达，从而实现某些生理功能，这一过程被称为QS[12]。

1.1 基于信号分子AHLs的群体感应系统

高丝氨酸内酯类化合物(AHLs)作为革兰氏阴性菌中最常见的一类自诱导物，被首次发现于海洋微生物费氏弧菌(Vibriofischeri)中[13-14]。其群体感应系统主要由自诱导物N-3-oxohexanoylhomoserine lactone (OHHL)及LuxI、LuxR蛋白组成(图1)。OHHL由LuxI 编码的酶合成,并且可以自由扩散进出细胞。随着细胞密度的增加，OHHL的浓度也随之上升，OHHL在微生物的生长过程中处于较低的基础浓度，但随着细胞密度上升就会达到一个足够的配体浓度,并与受体蛋白LuxR发生有效结合[15]。如果没有足够的OHHL配体，LuxR蛋白不稳定,且会快速降解。LuxR-OHHL蛋白质复合物作为转录激活因子，能诱导细菌发光基因LuxI的表达[16]。因此，当自诱导物开始产生，周围环境的信号分子就会导致自诱导物的产量增加，从而诱导相关基因的表达。

图1 费氏弧菌LuxI/LuxR群体感应系统模式图[17]Fig.1 Schematic of the LuxI/LuxR quorum sensing system in V.fischeri[17]

事实上，在一些革兰氏阴性细菌中发生的群体感应信号传递过程通常比图1所示的更为复杂。已经证实了一些细菌物种可以通过使用更为复杂的信号传输网络来进行细胞信号传递，其包含2个或者多个AHL信号分子，甚至涉及其他类型的群体感应通路[18-20]。例如:铜绿假单胞菌使用了至少3种群体感应信号系统，其中2种AHL分子，分别为N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone (OdDHL)和N-butanoyl-L-homoserine lactone (BHL)。它们是由2个独立的信号系统产生和感知的，每个信号系统都涉及一个LuxI型合成酶和一个LuxR型受体。OdDHL是由LasI产生的，LasR是其同源受体。BHL是由RhlI合成酶产生，被RhlR蛋白检测。这些依赖AHL的信号系统与第3个以2-heptyl-3-hydroxy-4(1H)-quinolone(称为喹诺酮假单胞菌信号或PQS)为信号分子的群体感应系统集成。假单胞菌中存在着群体感应调节的层级结构，通过LasR触发RhlR和PQS系统而被连续激活[18-20]。

1.2 基于信号分子AI-2的群体感应系统

AI-2是调控革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌种内和种间交流的一种非特异性自诱导物。基于AI-2的群体感应现象，是19世纪90年代在革兰氏阴性菌哈氏弧菌(V.harveyi)中被首次发现的[21]。在天然自诱导物缺乏的条件下，基于AHL群体感应系统的微生物菌株仍具有生物发光的能力[22]，这就表明:还有其他群体感应通路利用了独特的信号分子行使了相同的功能，而这个独特的信号分子就是AI-2。随后Bassler等[21]证明:来自多种细菌的无细胞培养液能够刺激哈氏弧菌(V.harveyi)报告菌株的活性[21]。近年来,对AI-2的群体感应研究逐渐增多[22-27]。研究发现:由哈氏弧菌、大肠杆菌和伤寒链球菌中的同一基因luxS负责AI-2的合成[23]。LuxS合成4,5-二羟基-2,3-戊二酮(DPD)，然后自发重排形成各种DPD衍生物，相互转化，平衡存在，形成AI-2信号分子库。DPD的环化产生了化合物S-DHMF和R-DHMF，但如果溶液中存在足够的硼酸盐，DPD就会生成硼酸酯[28]。不同的微生物菌株识别不同的DPD衍生物。AI-2库内分子的相互转化就可以使细菌识别自身的AI-2以及其他细菌产生的AI-2。因此，AI-2可以作为种间细胞-细胞通信的通用信号[29]。已经在70多种细菌中发现了这种被称为luxS的基因[24]，luxS基因的产物LuxS酶，除了负责AI-2的生物合成，在细胞中还具有代谢作用[24]，这可能为luxS的广泛存在提供了另一种解释[26]。

1.3 其他群体感应系统

二酮哌嗪类化合物DKPs(diketopiperazine)是一种新型的QS信号分子，可同时对种间和种内QS调节起作用[30-31]。DKPs信号分子是Stierle等[32]在1988年，于海绵共栖细菌微球菌(Micrococcusspp.)中首次发现的，当时共发现cyclo-(L-Pro-L-Ala)、cyclo-(L-Pro-L-Val)及cyclo-(L-Pro-L-Leu)3种DKPs信号分子。此后，人们陆续发现了多种具有活性的DKPs。DKPs是由2个氨基酸缩合而成的环二肽(DKP)，环二肽具有六元环骨架结构，并且有2个氢键给体、2个氢键受体，使得DKPs非常稳定且具有一定的功能[33]。DKPs可以作为一种交流语言,而用于革兰氏阴性菌中细胞之间的交流，例如:DKPs可与大肠杆菌(E.coli)和紫色素杆菌的LuxR系统结合，继而促进或猝灭群体感应。Cyclo-(D-Ala-L-Val)、cyclo-(L-Pro-L-Tyr)及cyclo-(L-Pro-L-Leu)具有激活或拮抗LuxR介导的细菌群体感应系统的作用[34-35]，E.coli产生的cyclo-(L-Pro-L-Met)能够有效地刺激SwrI类蛋白的突变，促进群聚运动的产生和生物被膜的形成[33]；相反，S.liquefaciensSwrI突变株的群聚现象被cyclo-(L-Pro-L-Tyr)竞争性抑制[34]，抑制了LuxR系统的群体感应现象的发生。

2 QS对希瓦氏菌致腐性的影响

希瓦氏菌是低温储藏条件下水产品主要的特异性腐败菌[36-37]。水产品的腐败过程复杂，微生物作用是导致食品腐败的重要原因，当腐败达到一定程度时，可以检测出群体感应信号分子，因此可以通过加强对群体感应的相关研究,进而防控腐败的发生。Zhang 等[38]研究发现:真空冷藏条件贮存的大菱鲆货架期终点的主要腐败菌为希瓦氏菌，同时，群体感应信号活性在贮藏期间明显增加；并且发现外源群体感应信号分子C4-HSL和C6-HSL的添加，明显加速了冷冻大菱鲆的腐败过程；因此，推测QS与冷藏大菱鲆的腐败相关。

感应现象不仅促进希瓦氏菌单菌的腐败特性,还有利于希瓦氏菌种间合作，提升腐败能力。Zhu 等[36]利用从低温条件下腐败的凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)中分离出的腐败希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)和波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)进行混菌和单菌条件下的致腐实验。根据细菌计数、挥发性盐基氮、三甲胺、挥发性有机化合物和感观评定的分析结果发现:凡纳滨对虾的货架期缩短；在腐败过程中，与希瓦氏菌种间有着一种合作关系，加强了相互的腐败特性；并且发现:添加了外源的群体感应信号分子cyclo-(L-Pro-L-Leu)不仅促进了微生物生长、胞外蛋白酶和胶原酶活性，也促进了腐败希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)和波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)生物被膜的生长，增强了其致腐性能。这表明:依赖于cyclo-(L-Pro-L-Leu)的群体感应有助于希瓦氏菌种间的合作。

很多学者对QS现象如何影响水产品的腐败进行了更深层次的研究，也给如何通过调控QS去防治腐败提供了新的方向。Zhang 等[37]从蛋白质组学的角度去评估不同AHLs信号分子对从冷藏大菱鲆中分离出的腐败希瓦氏菌ShewanellaputrefaciensZ4的作用。采用液相色谱质谱联用技术(LC-MS)对添加AHLs后的23个不同表达位点进行了筛选和鉴定。通过研究发现:在3种群体感应信号分子AHLs(C4-HSL、C6-HSL和O-C6-HSL)存在的条件下，涉及生长和新陈代谢、环境适应和调控的蛋白均出现了下调现象，而应激反应蛋白质的丰度和DNA连接酶活性上升，外源性C6-HSL和O-C6-HSL的作用显著。结果显示:基于AHL的QS信号分子对腐败希瓦氏菌的一些重要代谢特性产生了影响。

刘娜娜[39]发现:通过添加4种信号分子DKPs，即cyclo-(L-Leu-L-Leu)、cyclo-(L-Pro-L-Gly)、cyclo-(L-Pro-L-Leu)和cyclo-(L-Pro-L-Phe)对致腐能力不同的希瓦氏菌株的生长和生物被膜的形成均有正调控作用,且调控强度不一；对致腐能力差异明显的菌株中与腐败相关的基因表达量的调控作用也不相同，对于氧化三甲胺还原酶基因、硫氧还原蛋白还原酶基因具有正调控作用，而对于半脱氨酸合成酶B基因具有负调控作用[9]。张笑笑[40]研究发现:DKP-LuxR型QS系统在转录水平上调控S.baltica73的致腐能力以及菌膜形成能力;并明确了其调控通路，通过调控torS的表达来促进S.baltica73产三甲胺(TMA)和腐胺的能力；通过调控pomA的表达来促进S.baltica73菌膜形成能力。

3 群体感应抑制剂

群体感应抑制剂(quorum sensing inhibitors，QSIs)是指可以阻断细菌种内或种间信息交流，干扰和抑制细菌群体感应现象，且不影响细菌正常生命活动的物质。理想的QSIs应该具备几个特点：①低分子量；②对QS系统具有高特异性；③对宿主水解酶表现出稳定性；④对宿主无副作用[42]。水产品的腐败与腐败菌的QS相关，因此,对腐败菌的QS进行调控为水产品的保鲜提供了新的思路。

QSI的调控机制主要有以下3种类型：①抑制信号分子的合成，Burt 等[42]利用牛至精油提取物，通过影响AHL合成酶活性及受体的基因表达，抑制紫色色杆菌的紫色素产生及生物被膜形成能力；②降解信号分子，阻断QS信号通路，从而调控QS反应。阮志勇等[43]以pET32a为载体，在大肠杆菌中表达AHL lactonase的同源酶AiiK，降解AHL，从而治疗P.aeruginosa感染；③产生与信号分子结构类似物，与受体蛋白发生竞争性结合，进而抑制QS。汪洋等[44]设计了一个序列为HSIRTGSKKPVPIIY的多肽，可以与LuxS/AI-2系统的假定受体发生结合，从而阻止AI-2进入细胞。该多肽对Streptococcussuis、Staphylococcusaureus、E.coli、Salmonella、Listeriamonocytogenes和P.aeruginosa的生长均有抑制作用，此外，其他小鼠脾脏细胞几乎没有溶血活性和细胞毒性。

对能够阻断群体感应信号分子发挥作用或受体识别信号分子的识别过程，而不干扰细菌正常生理活动QS抑制剂的研究，尤其是天然抑制剂方面的研究受到了较多的关注[45]。天然抑制剂可以避免耐药性和其他副作用的产生，因而相对于其他抑制剂来说更为安全。叶晓峰等[46]通过研究发现:亚抑菌浓度的表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)能显著抑制波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)生物被膜形成、泳动能力和蛋白酶活性(P<0.05)，呈现浓度依赖性。因此，EGCG 在亚抑菌浓度下能够干扰S.baltica的QS 系统，有效抑制生物被膜形成，减弱致腐能力。Zhu 等[47]通过研究发现：绿茶多酚能够有效地抑制AI-2 和DKPs活性，且不抑制细胞生长和促进AI-2的降解，并以一种浓度依赖的方式抑制希瓦氏菌被膜形成、胞外多糖产量及细胞泳动性；此外，还能降低胞外酶活性和三甲胺的产量。通过转录组分析发现:茶多酚抑制了希瓦氏菌中luxS和torA基因的表达，与其QS活性及致腐能力的下降相符合。由于QS调控希瓦氏菌致腐能力的广泛性，因此，通过对希瓦氏菌QS的调控在水产品保鲜领域中的应用具有广泛前景。

4 结论与展望

综上所述，希瓦氏菌在海产品低温贮藏条件下的腐败过程中扮演着重要角色，QS对其致腐性能及被膜的形成能力有着重要的调控作用，因此，对QS的深入研究对做好低温条件下水产品的保鲜和保证其质量安全具有现实意义。目前针对希瓦氏菌QS的研究已经达到一定的水平和高度，也取得了一些成果，并且已经在一定程度上阐明了群体感应调控腐败特性的机制，但由于现实环境的多样性和不确定性，仍有很多关于QS的基础科学问题须要阐明，这些科学问题的揭示将有助于今后更有针对性地研发QS的抑制剂，对控制希瓦氏菌造成的食品腐败具有重要的意义。