肠杆菌科细菌群体感应系统的研究进展

李 点，董明盛，张秋勤

(南京农业大学 食品科学技术学院，江苏 南京 210095)

肠杆菌科细菌属革兰氏阴性杆菌，大多数寄生在人和动物的肠道中，可随排泄物分布于水、土壤和腐败的物质中[1-2]。其包含大肠菌群、沙门氏菌、痢疾杆菌和致病性大肠埃希菌等食源性致病菌，也包含欧文氏菌和果胶杆菌等食品腐败菌[3-6]，与人类关系密切。

群体感应(quorum sensing，QS)是微生物之间的一种信号交流机制，微生物通过分泌、释放一些被称作自诱导素(autoinducer，AI)的信号分子，感知其浓度变化，进而检测菌群密度、调控菌群生理功能，以此达到适应环境的最终目的[7]。QS普遍存在于微生物之间，肠杆菌也不例外。有研究证明，肠杆菌科细菌中的大肠杆菌毒力因子的表达、与宿主之间的相互作用、抗生素耐药性及细菌素合成等方面的调控均与QS密切相关[8]；QS还可调控沙门氏菌的基因表达，这些基因表达的变化通常涉及毒力基因调控，从而增强沙门氏菌的致病性[9]；此外，沙雷氏菌属、泛生菌属和耶尔森氏菌属细菌成员中也发现了QS的信号分子。

图1 EHEC的SdiA系统Fig.1 SdiA system of EHEC

由于肠杆菌科细菌大多是食源性致病菌或食品腐败菌，且研究证明毒力因子的调控表达和食品的腐败变质均与QS密切相关。当致病菌或腐败菌的数量大时，信号分子的浓度也在一个很高的水平上，达到一定阈值后，就会发生感染或引起食品的腐败变质，这对人体健康具有潜在危害。因此，分析肠杆菌科细菌QS系统在调控病原菌毒力因子的表达、降低病原菌毒力方面具有重要意义，此外还可以避免因为食品腐败变质造成的食品浪费，为食品防腐保鲜提供一个新的研究维度。本文中，笔者介绍了肠杆菌科细菌成员中涉及的QS系统类型、肠杆菌科细菌QS对于毒力基因和食品腐败变质调控的研究。

1 肠杆菌的群体感应系统类型

1.1 AHLs介导的Ⅰ型群体感应系统

LuxI/LuxR双组分构成的QS系统在革兰氏阴性菌中分布广泛，这类QS系统中的信号分子是N-酰基高丝氨酸内酯[10](N-acyl-homoserine lactones，AHLs)。AHLs是由一个高丝氨酸内酯环和酰基侧链组成，其活性的特异性取决于侧链中碳原子的数量和一些特异性基团的存在。肠杆菌科的QS系统在不同的AHLs参与下发挥作用，欧文氏菌属多产生3-oxo-C6-HSL，而在沙雷氏菌属、泛生菌属和耶尔森氏菌属中发现最多的则是C6-HSL、3-oxo-C6-HL和C4-HSL[11]。

AHLs介导的Ⅰ型群体感应系统中，信号分子由LuxI同源基因控制合成，LuxR同源物是信号分子的受体，与信号分子结合后被激活，调控下游基因的转录。然而有研究发现Gammaproteobacteria(γ变形菌)变形菌门的一个分支，包括Escherichia、Salmonella、Klebsiella和Enterobacter[12]，它们的基因组中没有LuxI类似功能的基因，因此无法自身合成AHLs，但却存在一个可以编码LuxR的同源物的基因(sdiA基因)。以大肠杆菌为例，虽然细菌本身不产生AHLs，但是它们却能感应并对其他细菌产生的异种的AHLs应答。图1为肠出血性大肠杆菌(EnterohemorrhagicE.coli，EHEC)中的SdiA系统，EHEC通过感应异种AHLs，并与SdiA结合，促进了耐酸系统的gad基因表达并诱导噬菌体的产生[13-15]。SdiA还能抑制肠出血性大肠杆菌的鞭毛(flagella)的基因和致病性岛(LEE)的基因[14,16]。沙门氏菌的sdiA可以感应到多种结构的AHLs，与之结合的同时激活2个srg基因座——rck(resistance to complement killing)操作子基因座和srgE(sdiA-regulaed gene E)基因座。前者参与沙门氏菌Pef(plasmid-encodes fimbriae)菌毛的生物合成，还具有侵袭宿主细胞并抵御补体杀伤的功能，后者编码了沙门氏菌Ⅲ型分泌系统(T3SS)效应子并通过T3SS2输入至宿主细胞[17]。

1.2 AI-2介导的Ⅱ型QS系统

在Vibrioharveyi中发现了第2种QS系统[18]，由自诱导物2(AI-2)介导，目前，在肠杆菌科中也发现了这种信号分子。luxS基因编码的LuxS酶以S-核糖基高半胱氨酸为催化底物合成4,5-二羟基-2,3戊二酮(DPD)，DPD是一种高度反应性的共聚合体，它很容易重新排列并进入其他反应，此化合物可以形成被不同菌种识别为AI-2的信号分子。该QS系统在肠杆菌科成员中研究最多的是大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌[19-20]，如图2所示，LsrB蛋白是 ABC 转运蛋白的受体[21]，可与环境中的AI-2结合，之后通过LsrC和LsrD蛋白形成的异二聚膜通道进入细胞内，AI-2信号转运所需的能量由LsrA提供。细胞内lsrACDBFEG操纵子的表达是受AI-2激酶LsrK和抑制因子LsrR共同调控的。lsrK和lsrR位于lsr操纵子的上游，其转录受lsrRK操纵子的调控。AI-2信号分子进入到胞内后，被激酶LsrK磷酸化后，与抑制因子LsrR结合，会使LsrR成为无活性的阻遏蛋白，使得其从lsr操纵子中释放出来，lsr和lsrRK的转录就会被激活。若没有AI-2磷酸后的物质存在，LsrR抑制因子就可特异性地结合在lsrRK和lsr之间的基因区，从而抑制lsr和lsrRK的转录，同时调控自身和LsrK的表达。

在肠杆菌科成员中，此型QS系统研究最多的是大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌。在致病性大肠杆菌中，LuxS酶参与了EHEC和 肠致病性大肠杆菌 (EnteropathogenicE.coli，EPEC)毒力因子的表达调控[22]。而在鼠伤寒沙门氏菌中[23]，LsrR会抑制沙门氏菌致病性-1(Salmonellapathogenicity island-1，SPI-1)和鞭毛基因表达，而外源性的AI-2可与LsrR结合使其失活。很多研究证明由于luxS基因的突变导致了细胞中AI-2的缺乏，比如对肠杆菌科细菌成员中粘质沙雷氏菌属[24]、沙雷氏菌属[25]、欧文氏菌属[26]和梨火疫病病原菌[27]的细胞活动均有一定影响。

图2 AI-2介导的Ⅱ型QS系统机制示意Fig.2 Mechanism diagram of AI-2-mediated type Ⅱ QS system

1.3 AI-3/肾上腺素/去甲肾上腺素介导的 Ⅲ型QS系统

这个新发现的QS系统可能是迄今为止发现的所有信号通路中最复杂的，此型QS系统中信号分子AI-3的完整结构和合成机制尚不明确。Ⅲ型QS系统具有Ⅱ型QS系统的许多特征，因为它也使用一种双组分调控系统，但是，与Ⅱ型QS系统不同的是，它除了可以感应AI-3这种新型信号分子，还可以利用人类应激激素肾上腺素(Epinephrine，Epi)或去甲肾上腺素(Norepinephrine，NE)向系统发出信号[28-31]，故由此可推测该型信号分子很大可能是具有Epi或NE类似结构的衍生物 。

如图3所示，EHEC进入结肠后通过结肠细胞膜上的组氨酸传感器激酶(HKs)感应AI-3和宿主产生的Epi和NE，在EHEC中鉴定到的HKs有2种，分别为QseC和QseE，它们对应的应答调节蛋白分别为QseB和QseF，组成了双组分系统QseCB和QseEF。QseC被AI-3激活后，启动信号级联，磷酸化的QseB结合并激活flhDC操纵子的转录，该操纵子是编码鞭毛调控子的flhDC主调节子，并与自身的启动子结合[32-33]，进而导致泳动性发生变化，有利于EHEC对肠上皮细胞的黏附和毒力作用。双组分系统QseEF与之不同的是：QseE不能感应细菌信号AI-3且其不参与鞭毛和泳动性的调控。AI-3介导的QS信号级联反应存在于所有肠杆菌科细菌中(大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌和鼠疫耶尔森氏杆菌)，在这些细菌中，这种级联的基因编码转录因子的染色体具有高度相似性且发挥着相同的作用，说明AI-3介导的QS系统在肠杆菌科细菌中具有功能守恒的特点[34]。

图3 AI-3/肾上腺素/去甲肾上腺素介导的 Ⅲ型QS系统机制示意Fig.3 Schematic diagram of type Ⅲ quorum sensing system mechanism mediated by AI-3/Epi/NE

1.4 EDF短肽介导的QS系统

寡肽-自诱导肽(autoinducing peptides，AIPs)通常是革兰氏阳性菌QS中的自诱导物，但是肠杆菌科中的大肠杆菌中同样发现了一种线型五肽(NNWNN)[35]QS因子EDF(extracellular death factor)。该系统参与了大肠杆菌细胞凋亡的调控。细胞凋亡又称细胞的程序性死亡(programmed cell death，PCD)，是多细胞真核细胞中由基因决定的细胞死亡的过程。大肠杆菌的mazEF体系是研究较多的细菌染色体上的毒素-抗毒素系统(toxin-antitoxin system，TA系统)之一，由QS因子EDF调控[35-36]。mazF基因负责编码一种稳定的细胞毒蛋白，mazE基因负责编码不稳定的可被ClpPA复合体降解的抗毒素[37]。MazF毒素是一种核糖核酸内切酶，可被形成特殊构象的MazE识别，聚合为六聚体模式，蛋白毒性被抑制，当环境压力抑制蛋白表达，MazE被ClpPA降解，MazF含量就会相对增加，从而启动细胞的死亡程序[38-39]。

mazEF可介导大肠杆菌的类凋亡死亡(apoptotic-like death，ALD)，此过程是一种QS现象，需要EDF的参与。EDF中的线型五肽 是Asn-Asn-Trp-Asn-Asn，这5种氨基酸的每一种对其活性都是必不可少的[40]。参与调控MazF、mRNA干扰毒素和1个同源毒素ChpBK的内切活性[41]。EDF可发挥3种作用：一是在体外可增强MazF和ChpBK的内切活性；二是克服抗毒素MazE抗MazF毒素的抑制活性；三是克服抗毒素ChpBI抗ChpBK毒素的抑制活性。此外，它还可以与MazF直接作用。因此，EDF作为一类QS系统，在肽自诱导物水平上对细菌进行调控。

1.5 吲哚介导的QS系统

许多革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌可产生大量吲哚作为细胞间信号，在肠杆菌科中，吲哚是由大肠杆菌和一些变形菌族的成员，如Proteusvulgaris、Providenciaspp.和Morganellaspp.[42]产生。吲哚由色氨酸生成，色氨酸酶由tnaA[43]编码 。

Hirakawa等[44]研究表明，吲哚可作为大肠杆菌细胞外的信号分子，可以诱导内源异型生物质输出基因acrD的表达，来增加细菌耐药性。具体诱导过程是由BaeSR和CpxAR这两种双组分体系介导的[44]，吲哚先作用于传感器激酶 BaeSR和CpxAP，信号分子经传递至同源应答调控子，调控子可直接结合到输出基因启动子区不同位点，从而上调其表达。此外，吲哚还可以调控生物被膜的形成[45]，调控LEE基因在肠致病性大肠杆菌中的表达[46]，并参与抑制细胞分裂，从而为质粒多聚体在细胞内的分解和稳定维持提供依据[47]。

与大肠杆菌不同，沙门氏菌不能产生吲哚[48]，Nikaido等[49]用吲哚处理沙门氏菌，证明了吲哚可以诱导与耐药相关的基因表达，包括ramA和acrAB，并且可以抑制SPI-1编码的宿主细胞入侵和鞭毛产生相关的基因表达。

2 肠杆菌QS系统研究的应用

2.1 肠杆菌QS对于毒力基因的调控

肠杆菌科的细菌毒力基因的表达依赖于QS系统的调控。肠杆菌科细菌的毒力主要包括毒素、水解酶、脂多糖(LPS)、胞外多糖(EPS)、O抗原、不同类型的鞭毛、细胞表面迁移能力、生物膜形成等。QS在肠杆菌许多动植物病原菌毒力中起着重要作用。

QS在沙门氏菌的毒力表型中起重要作用。Campos-Galvão等[50]研究发现沙门氏菌虽然不能合成与革兰氏阴性菌相同的AI-1，却有一个受体SdiA蛋白。在厌氧条件下，SdiA蛋白通过增强生物膜的形成和毒力基因的表达来影响沙门氏菌的肠溶性肠病行为。人工添加外源的AHLs后，特别是C12-HSL时，促进了沙门氏菌生物膜形成基因(lpfA、fimF、fliF、glgC)和毒力基因(hilA、invA、invF)的表达，增强了菌形成生物膜的能力。此外，近年来，一种涉及外膜蛋白Rck的新进入系统被发现，且有研究证明含rck的pefl-srgC位点受沙门氏菌群体感应的温度和转录调节因子SdiA的调控[51]，Abed等[52]通过质粒转录融合发现pefl上游预测的远端启动子，即PdflP2表现出依赖于SdiA和AHLs的活性，此外还发现在25和37 ℃时Rck表达可负面调控拟核相关的H-NS蛋白，这项研究有助于描述这种入侵蛋白在体内的作用，提供一个有效预防沙门氏菌致病的途径。

QS参与调控欧文菌属植物病原中毒力因子的表达，在这方面研究最深入的是胡萝卜软腐菌的AHL介导的QS系统。肠杆菌科细菌植物病原细菌产生多种降解植物细胞壁的水解酶(PCWDEs)。这些酶包括果胶裂解酶、纤维素酶、果胶甲基酯酶、聚半乳糖醛酸酶和蛋白酶[53]。胡萝卜软腐菌侵染植物后，引起多氯联苯类化合物的合成，引起植物组织的浸渍和软腐菌的发生。结果表明，QS参与了胡萝卜软腐菌毒力调控。E.carotovorassp.Carotovora(Ecc)在其某些菌株中可控制水解胞外酶的合成。在突变体中，AHL合成缺失，外酶合成减少，结果病毒活性下降[54-55]。此外，在没有AHL的情况下，Ecc SCC3193中，ExpR1和ExpR2这2个LuxR同源基因能够抑制胞外酶合成[56]。Cui等[57]发现，来自Ecc71菌株的ExpR参与了rsmA基因的转录调控，编码了RNA结合蛋白RsmA前体，这是一种抑制PCWDEs产生的全球性调控蛋白。在AHL缺失的情况下，ExpR与rsmA启动子结合并激活其转录。AHL抑制rsmA转录的激活和ExpR与rsmADNA的结合。

2.2 肠杆菌QS对于食品腐败变质的影响

肠杆菌科细菌QS还可造成食品的腐败变质。QS参与了鲜肉产品在需氧冷藏条件下的变质过程[58]。Blana等[59]研究发现牛至挥发油中存在的挥发性化合物对产AHL肠杆菌科的细菌生长有抑制作用，同时也抑制了肉腐败过程中的QS现象；真空包装的鱼子酱中肠杆菌科与乳杆菌、肉杆菌属及乳杆菌属某些种共同作用造成产品变质，且这些细菌在低浓度下也能产生AHL[60]。Martins等[61]对从冷鲜奶中分离的6株嗜冷肠杆菌进行16S rDNA测序，在其中4株中发现了在Hafniaalvei编码AHL合成酶的halI基因。且该基因在大肠杆菌中通过异源合成N-己二酰- DL-同聚丝氨酸内酯和N-3-己二酰- L-同聚丝氨酸内酯而显示其功能，这一功能也在实验菌株中得到了证明，此外在研究这些菌株对于牛奶品质的影响时发现某些菌株可以造成牛奶的腐败变质。

3 结论与展望

肠杆菌科细菌具有多种类型的QS系统，在某些情况下，在调节细胞过程中发挥着尤为重要的作用，许多研究证明肠杆菌中QS系统可参与细菌毒素、生物膜、细菌特性和许多生理活动，造成食品的腐败变质，对食品质量与安全有很大影响。但是人们对于肠杆菌QS的研究还处于初级阶段，现有的研究多为信号分子的检测，在食品中的作用机制研究还未深入，还有许多方面的问题需要解决探索。