丙酮丁醇梭菌钙离子结合蛋白多样性研究

董雨衡， 毛国涛， 谢慧， 张宏森， 王风芹， 宋安东

(河南农业大学生命科学学院，河南 郑州 450002)

钙离子(Ca2+)是真核生物细胞内重要的信使分子，但在原核生物中的功能尚不清楚。研究表明，钙离子能够影响细菌芽孢的形成、趋化性、异形胞分化、物质运输和侵染等生理过程[1]。钙离子结合蛋白(calcium binding protein，CaBPs)是对钙离子有高度亲和性的蛋白质，在与其他细胞成分相互作用时需要钙离子参与。真核生物CaBPs大多具有典型的EF手型(exchange factor hand，EF-hand)结构，这种结构由1个α螺旋、1个loop环和1个α螺旋构成，2个螺旋呈现近似垂直的形态。随着研究深入，在细菌中也发现了具有EF-hand结构的CaBPs。来自糖多孢菌(Saccharopolysporaerythrea)的Calerythrin蛋白质是第1个被发现的原核CaBPs，具有4个EF-hand结构，其中3个能结合钙离子，该蛋白质在细胞内主要起钙缓冲的作用[2]。来自根瘤菌(Rhizobiumetili)的Calsymin蛋白质是具有6个EF-hand结构的CaBPs，当编码Calsymin蛋白质的基因casA被敲除后，根瘤菌失去了与宿主共生的能力[3]。原核生物中CaBPs结构具有多样性，如在毒素蛋白家族(repeats in the structural toxin, RTX)中存在的β桶状结构(β-roll)序列重复结构、βγ-晶状体蛋白中的希腊钥匙(Greek key)结构域和免疫球蛋白质类似蛋白质(bacterial proteins with immunglobulin-like, Big-like)结构域等都具有钙离子结合能力[1]。尽管目前有些原核细胞CaBPs已经被鉴定出来，但是对其表征和功能鉴定等方面还缺乏进一步研究。

丁醇是具有广阔前景的高效清洁生物能源，传统的生物丁醇发酵是 ABE(丙酮、丁醇和乙醇)发酵，产物的得率受到钙离子的调控。CATHERINE等[4]研究表明，在P2培养基中添加碳酸钙能显著提高丙酮丁醇梭菌ATCC 824和拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)260的菌体生长速率和糖利用速率，菌体对丁醇的耐受能力提高了40%以上，总溶剂的产量提高31%～46%。LV等[5]研究表明，在培养基中添加碳酸钙可以使拜氏梭菌NCIMB 8052退化菌株DG-8052的菌体生长和溶剂产生提高了50%以上。苏增平[6]研究表明，在玉米秸秆水解液中添加碳酸钙或者胞内钙抑制剂后，钙离子对丙酮丁醇梭菌辅酶A活力有较大的影响。HAN等[7]在培养基中添加碳酸钙后发现，相对于其他缓冲盐而言，拜氏梭菌溶剂产量得到显著提高，添加氯化钙同样可以提高溶剂的产量。这些研究间接表明，碳酸钙的缓冲作用只是其提高溶剂产量的原因之一，钙离子的其他生理功能尚需要进一步研究。本研究利用生物信息学技术分析了丙酮丁醇梭菌ATCC 824 CaBPs结构和功能多样性，以期为揭示钙离子对丙酮丁醇发酵的影响机制及高产菌株的理性构建奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细菌CaBPs的结构域特征基序

目前原核生物CaBPs的钙离子结合结构域主要有EF-hand(具有loop环保守序列)、Greek key、重复的β-roll和Big-like共4种CaBPs的保守特征基序[8-14]，具体基序如下：

EF-hand基序：D.[DNS].[DENSTG].{3} [DENQSTAGC].{2}[DE]

Greek key基序：[DN][DN].{2}[TS]S

β-roll基序：GG.G.D.[GVALIPSCMNQT].

Big-like基序：DNSNKDITSAVTD.SN.D.{2}S.VT

其中，“.”代表1个任意的氨基酸残基，“[ ]”代表该位置的氨基酸残基是可变的，“{ }”代表1个氨基酸残基特定的重复次数。

1.2 丙酮丁醇梭菌数据库构建

根据NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的GeneBank数据库得到模式菌株丙酮丁醇梭菌ATCC 824(GenBank: AE001437)全基因序列及蛋白质序列信息，并构建本地Blast数据库以获得各蛋白质相应的核酸序列和蛋白质序列。通过GO数据库(https://www.ebi.ac.uk/QuickGO/)查询丙酮丁醇梭菌(Taxon: 272562)的GO注释信息，分别以生物过程、细胞组分和分子功能的GO注释信息构建本地背景数据库。通过KEGG数据库(https://www.genome.jp/kegg/kegg2.html)查询KO注释信息并构建本地背景数据库，通过本地数据库对上述预测蛋白质进行通路分析。

1.3 CaBPs预测及分析

通过典型的钙离子结合loop环结构基序在Protein Pattern Find(http://www.bioinformatics.org/sms2/protein_pattern.html)对上述数据库进行比对分析，得到含特定基序的蛋白质序列。由于所做背景数据库均是以Uniprot ID为基础，故将预测的蛋白质名字通过Uniprot(https://www.uniprot.org/uploadlists/)进行ID转换。通过OmicShare(https://www.omicshare.com/)的GO功能分类和KEGG通路分析工具对这些蛋白质进行分析。

2 结果与分析

2.1 CaBPs的结构多样性

2.1.1 EF-hand结构的CaBPs 典型的EF-hand结构由“螺旋-环-螺旋”构成，2个螺旋呈现近似垂直的形态，loop环中残基提供钙离子配位结构中所需的的氧原子，在1(X)、3(Y)、5(Z)、7(-Y)、9(-X)和12(-Z)位置与钙离子形成配体，3位置的残基通过主链羰基氧原子与钙离子结合。虽然CaBPs的EF-hand结构大多成对出现，但具有1个EF-hand结构的CaBPs也有报道。例如钙离子通道蛋白的Cav1.2亚基C端有1个EF-hand结构，并且在功能上能维持钙离子的动态平衡[15]；海藻酸结合蛋白中1个EF-hand结构也具有结合钙离子的能力[16]。因此，一些研究者认为有1个EF-hand结构的蛋白质也可能具有钙离子结合的能力。本研究以具有钙离子结合能力的loop环的特征序列基序进行比对，共发现221个具有EF-hand结构的蛋白质，其中21个蛋白质具有2个以上EF-hand结构(表1)，另外200个蛋白质则只具有1个EF-hand结构。

表1 丙酮丁醇梭菌ATCC824通过基序匹配得到的钙离子结合蛋白部分结果Table 1 Partial results of CaBPs obtained by motif matching of Clostridium acetobutylicum ATCC824

注：黑色加粗序列为匹配到的基序。下同。

Note: Black bold sequence is the matched motif. The same as below.

2.1.2 Greek key结构的βγ-晶体蛋白质家族 在真菌、细菌以及古菌中发现有大量结合钙离子的非晶状体βγ-晶状体蛋白，这类蛋白质一般由单个或多个Greek key结构构成，每2个结构之间通过1条短肽链连接，整个分子呈高度对称并且能够形成大小不同的多聚体，主要功能是压力应激蛋白质以协助微生物抵御不利生存环境[17]。通过蛋白质Greek key基序序列与丙酮丁醇梭菌ATCC824全蛋白质组对比，得到119个蛋白质序列，其中具有2～3个Greek key结构的蛋白质有8个(表2)。Greek key结构一般成对出现，形成2个反向平行的β折叠股结构(β-strand)，故认为具有1个Greek key结构的蛋白质对钙离子的亲和力较差。

表2 Greek key基序与丙酮丁醇梭菌ATCC824蛋白质组匹配结果Table 2 The matching result of Greek key motif with the proteome of Clostridium acetobutylicum ATCC824

2.1.3 β-roll结构的RTX蛋白质家族 一些革兰氏阴性菌能够分泌具有β-roll或者β-heliex结构的蛋白质，这些蛋白质包含外毒素RTX结构。RTX结构域由GG.G.D.[GVALIPSCMNQT].顺式重复排列构成，在不同的RTX家族成员重复5～45次，前6个氨基酸与钙离子结合形成配体，后3个形成β-strand结构。利用此特征的RTX 基序进行比对后得到7个具有β-roll结构的蛋白质，但是这7个蛋白质只具有1个特征基序结构，不构成重复排列，认为其结合钙离子能力较弱。

2.1.4 BIg-like domain结构的CaBPs 近年来，研究发现一些与细菌免疫球蛋白质类似的蛋白质也具有钙离子结合能力，通过这种结构的保守钙离子结合基序与丙酮丁醇梭菌ATCC824全蛋白质组对比，没有发现有该结合位点的蛋白质。

2.2 丙酮丁醇梭菌CaBPs的GO功能分析

基因本体论是国际通用的描述基因分类的数据库，统计上述各保守特征基序预测到的蛋白质，将221个具有EF-hand结构的蛋白质和8个具有Greek key结构的蛋白质共228个(有1个重复)目标蛋白质基因，通过本地丙酮丁醇梭菌GO背景数据库分析，以了解这些蛋白质在丙酮丁醇梭菌中的分布情况。经过分析这些蛋白质参与生物过程的有11个功能组，共计121个基因，主要集中在代谢过程、细胞过程和单细胞过程3个方面，分别占总体的26.89%、23.25%、17.37%(图1-A)；组成细胞组分的有8个功能组，共计93个基因，主要集中在质膜、质膜部分、细胞和细胞部分4个方面，分别占总体的27.60%、26.24%、18.55%和18.55%(图1-B)；具有分子功能的有9个功能组，共计151个基因，主要集中在催化活力和结合2个方面，分别占总体的51.68%和35.29%(图1-C)。

2.3 丙酮丁醇梭菌预测CaBPs的KEGG代谢通路分析

通过在KEGG数据库中分析上述CaBPs以了解其参与的代谢途径。根据丙酮丁醇梭菌KEGG注释信息对上述228个蛋白质进行通路分析。其中共有211个蛋白质被注释，这些蛋白质涉及59个代谢途径，表3中显示了蛋白质参与途径相对较多的14个代谢途径，主要包括代谢过程蛋白质36个、生物抗性基因合成蛋白质15个、次级代谢物生物合成蛋白质15个和信号传导双组份系统蛋白质13个，分别占总体的17.06%、7.11%、7.11%和6.16%。在其他途径中，比如参与氨基酸代谢的丙氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸和半胱氨酸途径等均低于3个蛋白质；参与丙酮酸代谢、核糖体、磷酸戊糖途径以及糖酵解等均只有1个蛋白质。

A：生物学过程；B：细胞组分；C：分子功能

表3 蛋白质参与最多的14个代谢途径

Table 3 Top fourteen metabolic pathways involving proteins

代谢途径Metabolic pathway蛋白质数量/个Number of proteins蛋白质比例/%Percentage of proteins编码IDCoding ID代谢过程Metabolic process3617.06ko01100抗生素生物合成Antibiotic biosynthesis157.11ko01130次级代谢产物生物合成Secondary metabolite biosynthesis157.11ko01110双组份系统Two component system136.16ko02020氨基酸生物合成Amino acid biosynthesis94.27ko01230微生物代谢Microbial metabolism83.79ko01120氨基糖和核苷糖代谢Amino sugar and nucleoside sugar metabolism73.32ko00520嘌呤代谢Purine metabolism73.32ko00230

续表

2.4 丙酮丁醇梭菌CaBPs的主要功能类群

通过GO与KEGG分析，在228个具有钙离子结合位点的蛋白质中，主要包括13个与信号传导相关蛋白质，其中有12个蛋白质具有EF-hand结构，1个蛋白质具有Greek key结构；4个与抗逆性相关蛋白质,都具有EF-hand结构；12个与物质运输相关蛋白质，其中有11个蛋白质具有EF-hand结构，1个蛋白质具有Greek key结构；9个与芽孢分化相关蛋白质,都具有EF-hand结构；17个与鞭毛与趋化性相关蛋白质，其中有16个蛋白质具有EF-hand结构，1个蛋白质具有Greek key结构；10个与催化活性相关蛋白质。还有一些蛋白质参与了DNA复制与修复、RNA合成、蛋白质合成和细胞壁合成等过程，表4重点总结了在丙酮丁醇梭菌中预测的具有特定功能类群的CaBPs。

表4 钙离子结合蛋白主要功能类群Table 4 Main functional groups of CaBPs

3 结论与讨论

产溶剂梭菌是生物法产丁醇的主要菌株，而钙离子对于丙酮丁醇梭菌的影响是显著直观的。相关转录组学与蛋白质组学研究表明，在芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌中有数百个基因受到外界环境中钙离子的影响，受影响的过程主要包括三型分泌系统和多糖的产生等[18]。本研究从不同的CaBPs结合钙离子的特征基序入手，预测了228个具有这些特征的蛋白质，然后对蛋白质进行GO功能分类和KEGG代谢通路分析。研究发现，该类蛋白质主要集中在生物信号、运动调控、生物代谢催化和细胞抗逆性等方面，存在于双组分系统、催化活性、碳水化合物运输、蛋白质代谢、芽孢形成与分化、鞭毛的组装与运动等通路中。通过对该类蛋白质功能分析，初步明确了钙离子在丙酮丁醇梭菌中的作用，为深入了解钙离子在丙酮丁醇梭菌中具体的生理功能和分子机制奠定了基础。

钙离子作为信使分子能够影响CaBPs生理状态，从而调控菌体的生长与代谢。CaBPs通过调控转录因子的磷酸化与去磷酸化调控下游基因的表达，与转录调控因子结合调控基因的转录，作为转录调控因子与DNA结合调控基因的转录[19]。本研究通过比对发现，丙酮丁醇梭菌CaBPs中有13个蛋白质为信号传导双组份系统蛋白质，如Q97M81和Q97IY1为感知传导组氨酸激酶，Q97ET7为感知传导蛋白质，Q97IR1和Q97GZ5蛋白质分别为趋化性感知传导蛋白质和趋化性组氨酸激酶，该类蛋白质可能为双组份转录调控系统成员，通过调控转录因子的磷酸化与去磷酸化调控基因转录。Q97LI2为丝氨酸蛋白质激酶，通过使其他蛋白质磷酸与去磷酸化而影响蛋白质的功能。Q97ML0、Q97JQ9、Q97IH3、Q97GB8和Q97D30为转录调控因子，Q97J80和Q97HC8为转录终止子，该类蛋白质可以直接与DNA结合从而启动或终止基因的转录与表达。

对蛋白质高级结构的解析有助于阐明蛋白质的工作机制[20]。文献报道具有催化活性纤维小体的脚手架前体蛋白质中存在高度保守的EF-hand结构，且具有钙离子结合能力，钙离子对诱导其折叠成正常的三级结构有重要的影响[21]。本研究结果显示，在丙酮丁醇梭菌中也发现了纤维小体，并且能够表达但其催化活力极低，该菌不能以纤维素作为唯一碳源生长[22]。丙酮丁醇梭菌ATCC 824的蛋白质组比对发现有了10个具有EF-hand结构的蛋白质，其中9个蛋白质具有2个以上的EF-hand结构，这些蛋白质的功能分别为脚手架前体蛋白质、纤维素酶前体和内切葡萄糖苷酶前体，推测这些酶组装成纤维小体需要钙离子的参与，但具体功能尚需进一步研究。预测蛋白质中存在一些ATP结合盒式蛋白质(ATP-binding cassette transporter，ABC)，该蛋白质家族是存在于所有生物体内的转运蛋白质，主要从事胞内外物质运输，作用底物非常广泛，比如金属离子、糖类、维生素等小分子，以及寡核苷酸、氨基酸、多肽、蛋白质、细胞代谢产物等大分子化合物。ABC转运蛋白质还参与细胞解毒、脂质稳态、信号转导、病毒防御以及抗原呈递等许多重要的生理过程[23]。本研究结果显示，在丙酮丁醇梭菌中发现具有钙离子结合能力的转运蛋白质12个，金属离子转运系统4个，其中Q97MQ1、Q97M30为预测的参与阳离子外排蛋白质；糖转运系统蛋白质1个；多种药物、蛋白质和脂类转运系统蛋白质1个。

研究发现在纯糖培养基中添加碳酸钙后能够消除甲酸对丙酮丁醇发酵的抑制作用，使溶剂产量提高近20倍[24]，间接说明了在丙酮丁醇发酵过程中添加钙离子可以提高菌体的抗逆能力。预测蛋白质中Q97H97为DnaK抑制蛋白质DskA，可能与该菌的抗高温等特性相关。Q97J76、Q97J74和Q97J73为碲酸盐抗性相关蛋白质，其相关功能研究目前较少。研究结果表明，炭疽杆菌碲酸盐抗性基因(YCEG)突变后，毒力会降低并且对抗生素和紫外线等敏感性增加[25]，推测该基因和抗逆能力相关，并且受到金属离子的影响。芽孢也是细菌抵抗外界不良环境的休眠体，芽孢内高含量的吡啶二羧酸钙是芽孢抗逆能力提高的关键，同时丙酮丁醇梭菌溶剂的产生与芽孢分化相耦合，即溶剂在芽孢形成的过程中产生，不能产生芽孢的退化菌种往往也就失去了产溶剂的能力[26]。在丙酮丁醇梭菌的基因组中有9个与芽孢形成相关的蛋白质含有钙离子结合位点，表明钙离子可能参与了调控芽孢形成和溶剂产生的过程。胞内钙离子浓度的变化能诱发大肠杆菌鞭毛运动(翻滚或单方向运动)[27]。生物膜上的趋化受体蛋白质感受外界刺激，然后传递到鞭毛马达受体，从而表现出趋化性，使微生物产生响应外界刺激的行为[28]。本研究结果中，丙酮丁醇梭菌有11个趋化性相关的蛋白质和4个鞭毛结构蛋白质都具有钙离子结合特征基序，表明丙酮丁醇梭菌的运动与趋化性受到钙离子的影响与调控。