宫颈微环境中ILC3细胞的表达及相关影响因素的分析

2020-05-22许莹莹刘萍冯勤梅

实用医学杂志 2020年8期

许莹莹刘萍冯勤梅

山西医科大学附属人民医院妇科（太原030001）

宫颈癌发病越来越年轻化，严重影响女性健康［1］。其发生、发展是一个比较漫长的过程，一般癌前病变需要数十年的时间才能发展为癌症［2］。目前普遍认为高危型HPV 的持续性感染是导致宫颈病变的主要原因，然而若机体免疫力正常，即便感染HPV，也会在一定时间内被清除。因此机体免疫在宫颈上皮内瘤变（cervical intraepitheli⁃al neoplasia，CIN）的发生、发展中起着重要作用。但是由于HPV 病毒的感染局限于子宫颈和黏膜，因而宫颈及阴道的局部免疫可能是病毒清除的重要决定因素［3］。

先天性淋巴细胞（innate lymphoid cell，ILC）是新近发现的一种固有淋巴细胞，根据ILC 发育、调控以及分泌的细胞因子分为4 类，3 类ILC 即ILC3，其发育依赖于转录因子维甲酸相关孤儿受体γt（RORγt），能够在IL-1β和IL⁃23 的刺激下分泌IL⁃22、IL⁃17 等细胞因子发挥免疫作用，参与炎症反应、抗病毒感染及粘膜稳态的维持，在多种肿瘤的发生、发展中有着重要作用［4］。但是对于ILC3 在阴道微生态、人乳头瘤病毒（HPV）感染以及CIN 的发生、发展中的作用尚不清楚。因此，本文拟对不同CIN 组织中ILC3 的变化进行研究，以期为CIN 的发生、发展及治疗找寻机制。

(1) 微网运行控制技术与传统的电力系统控制技术不同,微网侧重并、离网控制技术(分布式电源控制技术有下垂控制技术、v/f控制技术、p/v控制技术)。此外,微网整体运行控制也是微网领域的热点和趋势。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2018年11月至2019年4月就诊于我院的149 例宫颈病变患者为研究组，其中CINⅠ级30 例、CINⅡ级37 例、CINⅢ级36 例、宫颈癌患者46 例。选择同期在我院因良性疾病进行子宫全切且病理检查为宫颈炎的患者36 例为对照组。筛选标准：（1）经病理诊断为宫颈炎、CIN 或宫颈癌患者；（2）有性生活史、无子宫切除史、无其他免疫性疾病史；（3）非月经期、妊娠期及哺乳期女性；（4）取材前3 天无阴道冲洗、无阴道用药、无妇科检查、无性生活。研究组平均（44.97± 10.89）岁；对照组平均（44.81 ± 8.00）岁，两组差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 方法

2.3 宫颈组织中ILC3 细胞的表达CD3-IL17+细胞组间比较：CINⅡ组、CINⅢ组、癌症组与对照组之间差异具有统计学意义（P＜0.001）；CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组与癌症组之间差异有统计学意义（P＜0.05）；CINⅠ组与CINⅡ组、CINⅢ组之间差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.1 宫颈病变与pH 值、细菌性阴道病（BV）的关系宫颈病变组的pH 值高于对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05）；BV 的感染率随着CIN 程度的升高而增高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

细菌性阴道病的诊断标准：（1）匀质、稀薄、白色的阴道分泌物，常粘附于阴道壁；（2）线索细胞阳性；（3）pH＞4.5；（4）胺臭味试验阳性。4 项符合3 项即可诊断。

1.4 统计学方法采用SPSS 25.0统计软件进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差表示，统计分析采用t检验和方差分析，多因素分析采用Logistic回归分析，后续行两两比较，检验水准α=0.05。

1.2.3 ILC3 细胞免疫组化按照Spits［5］的定义，分泌IL⁃17 或者IL⁃22 的非T 细胞定义为ILC3 细胞，即将CD3-IL17+/CD3-IL22+细胞定义为ILC3 细胞。因此，按照迈新双染试剂盒步骤进行操作，IL17、IL22 表达为蓝色，CD3 表达为粉色，最终由两名病理医生在高倍显微镜下进行观察，选取5 个阳性细胞较多的高倍视野进行计数，取平均值。

从表2中的数据可看出，用GM(1，1)模型得到的预测值并不是很理想，其平均相对误差为0.038 2%。利用GM(1，1)预测模型来预测第8次沉降值，得到的预测沉降值为20.76，相对误差为0.055%，后验差比值C为0.065。

2.6 宫颈病变的危险因素经多分类Logistic 回归分析，以宫颈癌组作为参照组，与CINⅠ组相比，BV 感染是危险因素；与CINⅡ组相比，BV 感染CD3-IL17+/CD3-IL22+细胞个数< 8 是危险因素与CINⅢ组相比，BV感染，CD3-IL17+/CD3-IL22+细胞个数< 8 是危险因素，差异有统计学意义（P< 0.05）。见表7、8。

1.2.2 宫颈脱落细胞窥器暴露阴道，用无菌采样刷沿宫颈转5 ～8 圈刷取转化区细胞，放入固定液中，采用聚合酶链反应技术（PCR）检测HPV 感染情况，并进行宫颈脱落细胞的检测（TCT）。

学生是课堂授课的主体，在开展“对分课堂”教学的前期，要与学生进行充分的沟通.一方面，传达“对分课堂”的教学理念，目的是在于让学生充分的参与到物理课堂中，亲自动手模拟物理实验，生成数据，通过计算和绘制图表最终得到物理定理.另一方面，初次课程实践时应选取已经学过的知识开展.突然的模式转变可能会对学生的接受能力受到影响，尤其是涉及《选修2》和《选修3》的内容，十分深奥难懂，不适合作为教学探索阶段的实验课.每节体验课结束后要对学生的学习成果进行汇总，听取学生意见，例如对教材的理解，讲课思路的意见等，做好收集记录.

2 结果

1.2.1 阴道微生态窥器暴露阴道，取2 根无菌长棉签伸入阴道侧壁上1/3 段近穹隆处，旋转5 周，使棉签上附着有清晰分泌物。将1 根棉签涂抹于载玻片，后将棉棒置入加有2 mL 生理盐水的无菌管中，充分混匀后用进行微生态分析；载玻片干片后进行革兰染色，油镜下观察细菌、真菌；将一根棉签置入加有2 mL 生理盐水的无菌管中，搅拌后滴片，显微镜下观察滴虫。

表1 CIN 与pH 值、BV 的关系Tab.1 Relationship between cervical lesions and pH value、BV infection

2.4 ILC3与HPV感染之间的关系感染HPV16/18的宫颈组织中比未感染HPV16/18 的宫颈组织中CD3-IL17+/CD3-IL22+细胞数量少，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

任何时代环境下女性都是相对于男性而言更为敏感的群体，她们是时代社会发展的导向标。李劼人的《死水微澜》《暴风雨前》和《大波》中女性鲜明地反映了这一特征，她们处在时代社会发展最敏感的地带，她们受传统压迫最严重，却对现代社会最敏锐。她们以自身的身心变化反应着时代社会的变化发展。李劼人人笔下的女性有着传统妇女所没有的自由独立，对婚姻爱情的执着追求，而这些正是当代女性身上所体现的品格。她们在时代洪流中具有先导性和先锋性。

表2 HPV 感染与pH 值、BV 的关系Tab.2 Relationship between HPV infection and pH value and BV infection 例（%）

CD3-IL22+细胞组间比较：研究组各分组均与对照组之间差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ组与癌症组之间差异有统计学意义（P＜0.5）；CINⅠ组与CINⅡ、CINⅢ组之间差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表3、图1-10。

表3 不同病变级别宫颈组织中CD3-IL17+/CD3-IL22+细胞数目Tab.3 Numbers of CD3-IL17+/CD3-IL22+cells in different cervical lesiom tissues ±s

组别CD3-IL17+CD3-IL22+对照组17.06±3.71 18.31±3.36 CINⅠ组14.00±2.97 15.20±1.83 CINⅡ组11.11±4.52 10.38±3.15 CINⅢ组9.50±3.38 8.69±2.82癌症组4.50±1.82 4.02±1.81 F 值50.47 62.38 P 值＜0.05＜0.05

图1 宫颈组织炎症CD3-IL17+（双染，200×）Fig.1 Cervical tissue，inflammation，CD3-IL17+（DouS⁃P，200×）

图2 宫颈组织CINⅠCD3-IL17+（双染，200×）Fig.2 Cervical tissue，CINⅠ，CD3-IL17+（DouS⁃P，200×）

图3 宫颈组织CINⅡCD3-IL17+（双染，200×）Fig.3 Cervical tissue，CINⅡ，CD3-IL17+（DouS⁃P，200×）

图4 宫颈组织CINⅢCD3-IL17+（双染，200×）Fig.4 Cervical tissue，CINⅢ，CD3-IL17+（DouS⁃P，200×）

图5 宫颈组织癌症CD3-IL17+（双染，200×）Fig.5 Cervical tissue，cancer，CD3-IL17+（DouS⁃P，200×）

图6 宫颈组织炎症CD3-IL22+（双染，200×）Fig.6 Cervical tissue，inflammation，CD3-IL22+（DouS⁃P，200×）

图7 宫颈组织CINⅠCD3-IL22+（双染，200×）Fig.7 Cervical tissue，CINⅠ，CD3-IL22+（DouS⁃P，200×）

图8 宫颈组织CINⅡCD3-IL22+（双染，200×）Fig.8 Cervical tissue，CINⅡ，CD3-IL22+（DouS⁃P，200×）

图9 宫颈组织CINⅢCD3-IL22+（双染，200×）Fig.9 Cervical tissue，CINⅢ，CD3-IL22+（DouS⁃P，200×）

图10 宫颈组织癌症CD3-IL22+（双染，200×）Fig.10 Cervical tissue，cancer，CD3-IL22+（DouS⁃P，200×）

2.2 HPV 感染与pH 值、BV 的关系HPV 阳性患者中阴道pH 值＞4.5 的概率为86.30%，高于HPV阴性患者阴道pH 值＞4.5 的概率69.23%，差异有统计学意义（P＜0.05）；HPV 阳性患者BV 发生率为39.0%，高于HPV 阴性患者的BV 发生率17.9%，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表4 不同HPV 感染状态的宫颈组织中CD3-IL17+/CD3-IL22+数目Tab.4 Numbers of CD3-IL17+/CD3-IL22+in cervical tissues of different HPV infection states ±s

CD3-IL17+CD3-IL22+HPV16/18（+）7.34±3.91 7.35±4.24 HPV16/18（-）13.31±4.74 13±4.87 t 值8.69 7.83 P 值＜0.001＜0.001

2.5 ILC3 与PH 值、细菌性阴道病（BV）之间的关系阴道微环境中pH≤4.5 比pH＞4.5 的宫颈组织中CD3-IL17+/CD3-IL22+细胞数量多，差异具有统计学意义（P＜0.05）；BV 感染者与未感染者宫颈组织中CD3-IL17+/CD3-IL22+细胞少，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表5、6。

表5 阴道不同PH 值对宫颈组织中CD3-IL17+/CD3-IL22+数目的影响Tab.5 Effect of different PH values on the numbers of CD3-IL17+/CD3-IL22+in cervical tissues ±s

PH CD3-IL17+CD3-IL22+pH ≤4.5 14.75±4.46 14.71±4.67 pH＞4.5 9.98±5.09 9.93±5.18 t 值4.34 4.27 P 值＜0.001＜0.001

1.3 观察指标观察并分析不同宫颈组织中ILC3细胞（即CD3-IL17+/CD3-IL22+细胞）的表达情况，进而分析影响ILC3 表达的因素。

表6 阴道BV 感染状态对宫颈组织中CD3-IL17+/CD3-IL22+数目的影响Tab.6 Effect of vaginal BV infection on the numbers of CD3-IL17+/CD3-IL22+in cervical tissues ±s

CD3-IL17+CD3-IL22+BV（+）9.46±5.37 8.63±5.79 BV（-）11.51±5.60 11.90±5.50 t 值-2.39-3.97 P 值<0.05<0.05

表7 宫颈病变影响因素多因素Logistic分析（变量赋值表）Tab.7 Multivariate Logistic analysis of influencing factors of cervical lesions（table of variable assignment）

3 讨论

既往研究认为，阴道微生态在HPV 感染以及接下来的CIN 的发生发展中起了重要的作用［6］。阴道内环境平衡的破坏将引起多种生殖道感染性疾病，如BV、滴虫性阴道炎（TV）、外阴阴道假丝酵母菌病（VVC）、HPV 感染，甚至引起宫颈恶性病变［7］。阴道微生态失衡可破坏阴道微环境固有免疫防护机制，增加HPV 异常粘附，从而使上皮细胞受损［8］，增加病毒感染及宫颈细胞异常增生的可能。而且各类厌氧菌代谢产生的亚硝基胺的致癌作用，加速宫颈上皮细胞的转变，进一步增加CIN的风险［9］。本研究中发现，HPV 感染患者阴道微环境pH 值异常率、BV 感染率均高于HPV 未感染患者，表明阴道微生态失衡与HPV 感染之间存在关系；此外，本研究发现BV 感染率随着宫颈病变级别的升高而升高，且宫颈病变多因素分析表明，BV 是宫颈癌前病变进展为宫颈癌的危险因素，这与之前的研究一致［9］。这些结果也证明了阴道内环境与HPV 感染、宫颈病变之间的关系。

表8 宫颈病变影响因素多因素Logistic 分析Tab.8 Multivariate Logistic analysis of influencing factors of cervical lesions

本研究发现当pH 值升高时，宫颈组织中CD3-IL17+/CD3-IL22+细胞的表达减少（P＜0.05），表明健康的阴道微环境对于维持宫颈组织局部正常免疫具有重要作用。pH 值作为阴道微生态平衡状况的一项重要指示指标，与阴道微生物菌群的生长情况密切相关，当pH 值升高时，阴道内乳酸杆菌的生长受到抑制，菌群平衡被打破，进而可导致患者出现HPV 持续感染；而HPV 感染又进一步加剧阴道菌群失衡，使局部的免疫微环境形成的生物屏障遭到破坏，进而使宫颈局部的免疫功能出现异常，形成恶性循环，导致CIN［10-11］。在人类受试者中，缺乏T 辅助细胞17（Thelper cell 17，Th17）和ILC3 细胞的患者对于白色念珠菌易感，小鼠模型中，RORγt 缺陷者也不能控制白色念珠菌的感染。这表明ILC3 可能对白色念珠菌的感染也起着很大的作用［12］。而本研究中并没有表现出ILC3与VVC 的关系。本研究表明BV 阴性患者宫颈局部CD3-IL17+/CD3-IL22+细胞少，可能说明此时免疫功能低，导致BV 易感。因此考虑阴道微生态的变化导致阴道局部免疫功能的变化，使HPV 更容易感染，继而引起CIN 的发生发展。

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众所周知HPV 感染是CIN 的病因，感染HPV后，若机体免疫功能正常，可清除病毒。若机体免疫功能下降，不能清除HPV，则HPV 便整合至宿主细胞，使细胞抑癌基因突变，导致细胞异常增殖和恶变，引起CIN。研究表明高级别宫颈病变患者CD4+T 细胞少于CINⅠ患者，且T 细胞变化与HR⁃HPV有关［13］，表明高危型HPV 感染会导致局部免疫功能下降。本研究表明，HPV 感染者宫颈组织中ILC3 细胞表达减少。ILC3 主要是通过分泌细胞因子IL⁃22 直接作用于非造血细胞，调节适应性免疫，来介导组织抵抗病原体的感染［14］。当ILC3 减少时，所分泌的细胞因子减少，介导的非造血细胞产生的清除病毒的作用也下降。

ILCs 可以在感染和组织损伤后早期分泌细胞因子IL17、IL22，因此在细胞因子介导的免疫系统激活和促进上皮细胞屏障完整性中具有关键作用。这表明ILCs 不但可以在癌变的早期阶段发挥作用，但最终也会塑造肿瘤微环境。它不但可以通过表达能够识别癌细胞的自然细胞毒性受体（natural cytotoxicity receptor，NCR）NKp46 和NKp44识别肿瘤细胞，也可以通过与辅助细胞如树突状细胞、巨噬细胞或上皮细胞相互作用识别癌细胞，辅助细胞表达炎性小体，炎性小体是一种大型的蛋白质复合体，能够感知各种损伤相关的分子模式，并在损伤组织中启动免疫反应，促进IL⁃1β的产生，进而激活ILC3［15］。ILC3 被激活后，分泌细胞因子，引起一系列的抗肿瘤反应。在慢性结肠炎模型中，早期IL⁃22 的产生被认为通过限制组织损伤在癌变中发挥保护作用。IL⁃17 可以通过T 细胞依赖性机制抑制肿瘤细胞生长，内源性IL⁃17 在接种结肠癌细胞株的小鼠中有助于降低肿瘤生长和转移［15］。在黑色素瘤的实验模型中，表达NKp46 的细胞通过转录因子RORγt促进肿瘤排斥反应［16］。本研究结果为CD3-IL17+细胞、CD3-IL22+细胞均随着宫颈病变程度的增加而表达减少，表明ILC3 在宫颈病变中表达减少。先前研究也认为ILC3 在非小细胞肺癌、黑色素瘤等癌症中表达减少［16-17］。这一结果可能的机制是：（1）在宫颈癌组织中辅助细胞数量减少，不仅分泌的细胞因子减少，导致对肿瘤细胞的杀伤减少；而且影响ILC3 细胞对肿瘤细胞的识别，导致ILC3 对肿瘤细胞的杀伤减少；（2）肿瘤免疫微环境中存在免疫逃逸现象。肿瘤浸润的调节性T 细胞可以抑制特异性免疫反应，不仅促进肿瘤细胞的生长，而且间接抑制ILC3 细胞的活性［18］。

总之，ILC3 细胞数量在CIN 组织中是降低的,表明宫颈病变患者局部免疫功能下降，因此机体清除病毒功能减弱，导致癌症。BV 的感染，pH值的改变导致阴道微环境失衡，ILC3 细胞数量减少，局部固有免疫功能降低，HPV 感染更容易发生，进一步加剧阴道微环境的破坏、免疫功能的下降，增加了CIN 的发生及进展，最终导致宫颈癌的发生。该研究为CIN 的发病机制提供了新的研究方向。