低氧诱导的HIF⁃1α对结肠癌细胞生长代谢的影响及其调控机制

何伟玲 李清海 严时佳 万国辉

1中山大学附属第一医院胃肠外科（广州510080）；2中山大学药学院（广州510006）

缺氧是实体肿瘤的一个典型特征。由于肿瘤细胞的增殖不受机体调节，当其增殖速度超过新生血管的生长速度时，则会在肿瘤内部距离血管大于180 μm（正常氧气弥散距离）处形成一个缺血缺氧的微环境，同时由于肿瘤内部的新生血管通行性较差，更进一步促进了肿瘤内部缺氧微环境的形成［1］。缺氧诱导因子（hypoxia⁃inducible factor，HIF）家族是低氧环境下细胞代谢改变的主要启动因子［2］，它由α亚基和β亚基组成，其中β亚基恒定表达，而α亚基作为主要调节亚基，自身受到氧浓度的调节［3］。绝大多数HIF 靶基因受到的是HIF⁃1α的调控，其诱导激活的信号通路参与并促进了一系列恶性肿瘤的进展。

研究指出，由HIF 转录激活因子诱导产生的异常血管生成、能量代谢异常如糖酵解和线粒体功能抑制等改变更加明显，其中糖酵解产生的乳酸等酸性代谢产物聚集又可导致肿瘤微环境的pH 值下降，进一步激活更多与肿瘤代谢相关的酶［4］；此外，缺氧环境还诱导了许多肿瘤特异性的改变，如抑癌基因启动子的甲基化修饰［2］、促进肿瘤细胞和浸润性免疫细胞免疫抑制表型的形成和免疫逃逸［5-7］、促进肿瘤细胞上皮-间质转化［8］、促进转移前生态位的形成［9］、促进远处转移点肿瘤细胞的存活［10］等，在以上缺氧诱导性改变的共同作用下，肿瘤细胞可发生不同程度的增殖、侵袭、转移和以放疗为主的治疗抵抗，使患者预后不良。但同时也有报道指出，HIF 有时也可对肿瘤起负调控作用，参与诱导肿瘤细胞凋亡［11］。

结肠癌（colorectal cancer）在传统的化疗联合靶向治疗方面取得了巨大的进展，但目前最大的挑战仍是药物的耐药性问题［12］，其中低氧HIF 对不同药物在肿瘤中产生获得性耐药起着至关重要的作用。随着分子医学的进步，陆续有学者提出靶向HIF 的肿瘤治疗策略，但HIF 的异型性行为是这种策略实施的主要障碍［13-14］，因此更清晰了解HIF 的作用机制尤其是在肿瘤细胞负性调控机制尤为重要。本研究通过系统比较结肠细胞在常氧低氧中表达差异的基因，通过基因富集分析首次发现在低氧培养的结肠癌中与细胞生长代谢相关的岩藻糖基转移酶Ⅳ（fucosyltransferase 4，FUT4）基因表达下调，预示了结肠癌肿瘤细胞代谢相关信号通路的异常和对潜在耐药性的影响，并进一步探索了HIF⁃1α对其具体的负性调控机制及病理生理意义。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器基因表达芯片（GSE77606，基因表达数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）），HCT⁃116 和HT⁃29 细胞系（美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection，ATCC），杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM）（Corning，美国），10%FBS，支原体染色试剂盒（C0296，Beyotime，中国），GenePrint 10系统（B9510，Promega，美国），HIF⁃1α 特异性的短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）慢病毒载体，Quick ChangeⅡ定点突变试剂盒（200523，Agilent，美国），pCDH⁃puro 慢病毒载体（CD510B⁃1，System Biosciences），8mg/ml 溴化己二甲胺（TR⁃1003，Sig⁃ma），1 μg/mL 嘌呤霉素，Trizol 试剂（ThemoFisher，美国），PrimeScript RT 试剂盒（RR036A，Takara，日本），荧光染料SYBR⁃Green（RR820B，Takara，日本），双荧光素酶载体pmiGLO（C838A，Promega，美国），双荧光素酶报告基因检测试剂盒（RG028，Beyotime，中国），微小RNA（microRNA，miRNA）模拟物，miRNA 拮抗剂，各类引物和低氧培养箱。

1.2 方法

1.2.1 芯片数据分析从GEO 中筛选并下载符合研究条件的芯片（GSE77606），随后使用R 语言（3.4 版本，http：//www.bioconductor.org）的edgeR 包对其进行基因差异表达分析。基因表达差异用log2 fold change（log2FC）计算，当log2FC ≥1、log2FC <-1 和P< 0.05 认为差异有统计学意义。利用在线工具KOBAS.3.0（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/anno_iden.php）和DAVID 6.8（http：//david.ncifcrf.gov）对差异基因进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，探讨差异表达基因的激活途径，P<0.1认为差异有统计学意义。同时在TargetScan数据库（http：//www.mirdb.org）筛选出与目的基因mRNA 的3'端非翻译区（3'untranslated region，3'⁃UTR）互补的miRNA 以及在癌症基因组图谱（The Cancer Genome Altas，TCGA）数据库（https：//portal.gdc.cancer.gov/）中查找并分析原始结肠癌标本中目的基因的表达情况。

1.2.2 细胞培养HCT⁃116 和HT⁃29 细胞系来源于ATCC，并培养在37 ℃条件下、含10%FBS 和5%CO2的DMEM 中。并使用支原体染色试剂盒检测有无支原体污染。同时使用GenePrint 10 系统的STR 分析对细胞系进行鉴定，具体操作参照制造商的说明书执行。缺氧条件下的细胞系培养在低氧培养箱中进行，箱内具体气体含量参数为1%的O2，5%的CO2和94%的N2。

1.2.3 引物及shRNA 设计通过美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Infor⁃mation，NCBI）基因库查找相应的基因序列，并按照引物及干扰RNA 设计基本原则，设计出目的基因、对应的miRNA 和HIF⁃1α 的引物序列及HIF⁃1α⁃sh RNA 序列。

1.2.4 定量反转录PCR（quantitative reverse tran⁃scription PCR，QRT⁃PCR）采用Trizol 试剂分离RNA，具体操作参照制造商的说明书执行，并使用PrimeScript RT 试剂盒合成相应的cDNA。采用荧光染料SYBR⁃Green 对扩增产物进行实时定量检测。

1.2.5 荧光素酶报告实验和突变实验如前报道［15］，以HCT⁃116 细胞cDNA 为模板，用PCR 方法扩增目的基因mRNA 的3'⁃UTR 序列，将其克隆到双荧光素酶载体pmiGLO 中，同时再利用美国安捷公司的Quick ChangeⅡ定点突变试剂盒对3'⁃UTR序列中的miRNA 结合位点进行定点突变，分别构建位点1、位点2 以及位点1 和2 共突变载体，同时用miRNA 模拟物、miRNA 拮抗剂和对照再次进行分组。用双荧光素酶报告基因检测试剂盒测定荧光素酶活性，表达效率用均一化后的萤火虫荧光素酶信号和海肾素荧光素酶信号来反应。

1.2.6 基因表达载体的构建和感染靶基因的稳定敲减由慢病毒介导的HIF⁃1α⁃shRNA 来执行，而靶基因的沉默和过表达则由pCDH⁃puro 慢病毒载体实现。在相应病毒载体构建完成后，将符合要求的病毒载体在8 mg/mL 溴化己二甲胺的介导下感染靶细胞。最后用1 μg/mL 嘌呤霉素筛选出对应的获得稳定敲减、敲除、沉默或过表达的细胞。

1.3 统计学方法采用SPSS 19.0 对实验数据进行分析，两独立样本采用t检验，多组定量数据采用方差分析，当P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 数据分析结果及验证GEO 芯片数据（GSE⁃77606）及KEGG 通路富集分析显示低氧环境下结肠癌细胞的代谢通路异常（P= 0.036），FUT4 表达下调（图1A、B）。QRT⁃PCR 证实FUT4 在低氧培养的结肠癌细胞系HCT⁃116 和HT⁃29 中低表达，其在HCT⁃116 中表达明显降低（P< 0.001）（图1D），而TCGA 数据库资料显示原始结肠癌标本中FUT4 基因表达升高（P<0.05）（图1C）。

图1 数据分析及验证结果Fig.1 Bioinformatics analysis of colon cancer cells under hypoxia and validation of FUT4 expression

2.2 miRNA 筛选结果在TargetScan 等数据库中筛选到与FUT4基因mRNA3'⁃UTR 互补的miRNA为hsa⁃miRNA⁃23a⁃3p，且该miRNA 与FUT4mRNA存在两个靶向作用位点，分别为位点1（第781⁃788位碱基）和位点2（第867⁃873 位碱基）。见图2。

2.3 相关基因引物及干扰RNA 序列设计通过美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NICB）基因库查找到相应基因序列。根据引物及干扰RNA 序列设计基本原则，确定了相关基因引物序列及HIF⁃1α⁃shRNA干扰序列。见表1。

图2 FUT4（mRNA）⁃hsa⁃miRNA⁃23a⁃3p 匹配结果Fig.2 Complementary matching analysis of hsa⁃miRNA⁃23a⁃3p in the 3'UTR of FUT4

表1 引物序列及干扰RNA 序列Tab.1 Real⁃time PCR primer sequences and shRNA sequence

2.4 荧光素酶报告实验和突变实验结果及hsa⁃miRNA⁃23a⁃3p表达验证荧光素酶报告实验和突变实验显示荧光强度除了与hsa⁃miRNA⁃23a⁃3p的浓度有关外，还与作用位点有关，证实hsa⁃miRNA⁃23a⁃3p 可通过靶向位点1 和位点2，促进FUT4mRNA 的降解，其中位点1 在FUT4⁃hsa⁃miRNA⁃23a⁃3p 的相互作用中起主要介导作用（图3A）。同时证实了低氧环境可诱导hsa⁃miRNA⁃23a⁃3p的表达（图3B）

2.5 HIF⁃1αsh RNA干扰实验结果HIF⁃1αsh RNA干扰实验显示，正常氧环境下，HCT⁃116 细胞中HIF⁃1α的表达与hsa⁃miRNA⁃23a⁃3p的表达无明显相关性，但在低氧环境下，与无义干扰相比，用特异性的shRNA 对HIF⁃1α进行干扰后，hsa⁃miRNA⁃23a⁃3p的表达明显下调（图5，P< 0.05）。上述实验说明HIF⁃1α可作为转录激活因子调控miRNA⁃23a⁃3p 的表达。

2.6 FUT4⁃hsa⁃miRNA⁃23a⁃3p相关性验证hsa⁃miRNA⁃23a⁃3p过表达和沉默实验显示，当在HCT⁃116细胞系中导入反义表达miR⁃23a的质粒miRZip⁃23a时，FUT4基因的表达明显升高，相反，当细胞内导入的质粒为miR⁃23a⁃3p过表达载体时，FUT4基因的表达明显下调，即hsa⁃miRNA⁃23a⁃3p 可调控FUT4mRNA 的表达水平（图5，P<0.05）。

图3 荧光素酶报告实验和突变实验结果及hsa⁃miRNA⁃23a⁃3p 表达验证Fig.3 Results of luciferase activity assay and measurement of hsa⁃miRNA⁃23a⁃3p expression

图4 HIF⁃1αshRNA 干扰实验结果Fig.4 Results of HIF⁃1α knockdown assay

图5 QRT⁃PCR 检测不同诱导条件下FUT4 的表达情况Fig.5 Measurement of FUT4 expression under hypoxia by QRT⁃PCR

3 讨论

结肠癌作为胃肠道中最常见的恶性肿瘤之一，近20年来，其发病率呈明显上升趋势，目前结肠癌的发病率和病死率分别排在胃肠道肿瘤的第一位和第二位［16］。同时结肠癌作为一类实体肿瘤，在其快速增长的过程中往往也会因为新生血管生长滞后和通行性差而导致肿瘤细胞缺氧状态的形成，因此对结肠癌在低氧状态下的病理生理机制探索具有重要的预防和治疗意义。本研究发现，低氧环境下结肠癌细胞可通过HIF⁃1α/hsa⁃miRNA⁃23a⁃3p/FUT4轴下调FUT4的表达。

如前所述，HIF⁃1α作为缺氧反应相关基因表达的转录激活因子和调节因子，它可以与位于靶基因5'或3'区的缺氧反应原件的增强子结构域结合促进其转录和表达，主要促进肿瘤恶性进展，但有时也可促进肿瘤细胞凋亡。其中缺氧反应元件主要包括血红素氧合酶-1、血管内皮生长因子、糖酵解酶、葡萄糖转运蛋白1/4 和一些肿瘤特异性表达基因或非编码RNA［17］。miRNA 是一类由内源基因编码的长度约为22 个核苷酸的非编码RNA，虽不直接翻译蛋白参与细胞的生命代谢活动，但可在动植物中参与转录后基因表达调控，每个miR⁃NA 可以有多个靶基因，而不同的miRNA 也可靶向同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA 来调控多个基因的表达，也可通过几个miRNA 的组合来精细调控某个基因的表达。研究显示，miRNAs 在恶性肿瘤的发展过程中既可作为肿瘤促进因子又可作为肿瘤抑制因子。但针对miRNA⁃23a⁃3p 在结直肠癌中的研究少有报道。

FUT4属于岩藻糖基转移酶（fucosyltransferase，FUT）家族，是一类具有重要生化作用的糖基转移酶。该家族目前共13 个成员，主要负责催化从核苷二磷酸岩藻糖中将岩藻糖基转移到受体分子上，其中受体分子主要为糖蛋白或糖脂分子上的寡糖链［18］，但有时也可直接将岩藻糖基转移到多肽链上［19］。存在于细胞表面且被岩藻糖基化的寡糖包括Lewis A（Le（a））、Lewis B（Le（b））、Lewis X（Le（x））（CD15 抗原）、Lewis Y（Le（y））等路易斯寡糖和sialylLewis A（sLe（a））、sialylLewis X（sLe（x））等被唾液酸化的路易斯寡糖，其中FUT4主要负责合成Le（x）/CD15 和Le（y）。这些寡糖链是细胞表面糖蛋白和糖脂发挥其生理功能的重要组成部分之一，可参与细胞识别与黏附、胚胎着床与发育、白细胞迁移等炎症反应以及肿瘤细胞的迁移进展和免疫逃逸等生理过程［20］。

目前的研究显示，FUT4及其修饰的岩藻糖基化糖蛋白抗原（以Le（x）/CD15 为主）的过表达与包括结肠癌在内的多种肿瘤的发展、转移和化疗抵抗有关［21］，这与本研究从TCGA 数据库中获得的分析结果一致（图1C）。GIORDANO 等［22］的研究表明，约43%的转移性结直肠癌患者标本中CD15/FUT4呈高表达状态，且与低表达者相比，CD15/FUT4高表达的患者肿瘤内部CD3+和CD8+T 细胞比例下降，且对西妥昔单抗和贝伐珠单抗等靶向药物的原发耐药率明显更高，预后也更差，这意味着FUT4可以促进肿瘤的转移、耐药和免疫逃逸。另一项研究指出［23］，在正常氧浓度培养的SW620和SW480细胞系中加入可靶向FUT4mRNA的miR⁃26a/26b 模拟物可抑制肿瘤细胞的侵袭性生长。而在其他肿瘤的相关研究中同样证实，FUT4可参与乳腺癌细胞的上皮-间质转化以促进细胞侵袭性生长［24］，miR⁃493⁃5p 则可通过靶向FUT4mRNA降低乳腺癌细胞的侵袭性和致瘤性［25］。而miR⁃NA⁃125a⁃5p 可以通过靶向FUT4mRNA 进而抑制膀胱癌的进展［26］。

但在本研究中，结肠癌细胞可以通过HIF⁃1α/hsa⁃miRNA⁃23a⁃3p/FUT4轴下调FUT4的表达，这可以理解为是HIF 对肿瘤的又一个负调控机制。HIF 和FUT4目前被公认为是恶性肿瘤侵袭性进展和转移主要的促进因素。但有趣的是，本研究证实了这两大因素之间存在负调控关系。虽然在原始结肠癌标本中，FUT4的表达是上调的，但可以肯定的是，这种表达差异并不是由HIF 所诱导的，或许还有其他拮抗HIF 诱导FUT4表达下调的机制值得进一步探索。