高效液相色谱法测定决明子4 种成分含量

申玉龙，徐 达，金艳敏，刘 勇，王立伟，安丽娜△

（1. 承德燕峰药业有限责任公司，河北 承德 067600； 2. 河北省人民医院，河北 石家庄 050051）

决明子主要含蒽醌类，有橙黄决明素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、美决明素、黄决明素、决明素、芦荟大黄素等多种蒽醌苷元和与糖结合成的苷类[1－4]，具有清热明目[5]、润肠通便[6]功效。2015年版《中国药典（一部）》[7]中以橙黄决明素和大黄酚为决明子药材的检测指标，其供试品溶液的前处理方法烦琐、复杂。本研究中采用普通的高效液相色谱仪、等度洗脱，同时测定了决明子中橙黄决明素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量。现报道如下。

1 仪器与试药

仪器：LC－20AT 型高效液相色谱仪，包括DGU－20A型泵，SPD－M20A 型二极管阵列检测器，LC－solution 型色谱工作站，SIL－20A 型自动进样器（日本岛津公司）。

试药：决明子药材（共3 批，承德燕峰药业有限责任公司），由河北省药品检验研究院韩桂茹主任药师鉴定为决明子Gassia obtusifoliaL. 的种子；橙黄决明素对照品（批号为111900－201202，供含量测定用，含量以95.0%计），大黄素对照品（批号为110756－200110，供含量测定用），大黄酚对照品（批号为110796－201319，供含量测定用，含量以99.6%计），大黄素甲醚对照品（批号为110758－201013，供含量测定用，含量以99.8%计），均购自中国食品药品检定研究院；甲醇（批号为161218）、乙腈（批号为161123）均为色谱纯，均购自天津市科密欧化学试剂有限公司；磷酸（分析纯，天津市红岩化学试剂厂，批号为090903）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：迪马Dimonsil 柱（150mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈－甲醇－0.1%磷酸溶液（49∶7∶44，V／ V／ V），等度洗脱；柱温：30℃；检测波长：222nm；流速：1.0mL／min；进样量：10μL。理论板数按橙黄决明素峰计应不低于6000。

2.2 溶液制备

对照品溶液：取在干燥器中干燥24 h 的橙黄决明素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成原液，取原液适量，加90%甲醇制成每1 mL含橙黄决明素0.009 mg、大黄素0.004 mg、大黄酚0.015 mg、大黄素甲醚0.004 mg 的混合溶液，即得。

供试品溶液：取决明子药材细粉0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇－盐酸溶液（10 ∶1，V／ V）25 mL，称定质量，置80 ℃水浴中加热回流30 min，放冷，若瓶壁有黏附，超声去除，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液3 mL，置10 mL容量瓶中，加2%氢氧化钠溶液1.5 mL，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

线性关系考察：取每1mL 含橙黄决明素0.01232mg、大黄素0.008 7 mg、大黄酚0.014 78 mg、大黄素甲醚0.008 mg 的对照品溶液，分别进样2，5，10，15，20 μL，测定峰面积，以进样量（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归。回归方程分别为，橙黄决明素Y＝3 396 367.8X＋770，r＝0.99999；大黄素Y＝3822412.5X－392 3，r＝0.999 99；大黄酚Y＝5 819 232.8X－6 655，r＝0.999 99；大黄素甲醚Y＝2 929 021.8X－7 557，r＝0.999 98。结果表明，橙黄决明素、大黄素、大黄酚、大 黄 素 甲 醚 进 样 量 分 别 在0.024 64 ～0.246 4 μg，0.017 4 ～0.174 μg，0.029 56 ～0.295 6 μg，0.016 ～0.16 μg 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取同一对照品溶液，连续进样5 次，每次10 μL，测定峰面积。结果橙黄决明素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的峰面积平均值分别为284 616，77 743，780 744，131 634，RSD分别为0.63%，0.41%，0.40%，0.51% （n＝5），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于0，1，2，8，24 h 时进样，测定峰面积。结果橙黄决明素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的RSD分别为0.41% ，0.27% ，0.06% ，0.64% （n＝5），表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

重复性试验：依据2015年版《中国药典（四部）》中药品质量标准分析方法验证指导原则项下规定，采用同一浓度的6 份样品进行评价，即以100%的剂量，取同一批样品（1 号样）6 份，依法制备供试品溶液，并测定含量。结果样品中橙黄决明素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的平均含量分别为1.430，0.350，2.251，0.792 mg／g，RSD分别为0.13%，0.42%，0.09%，0.32% （n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：按重复性试验项下方法，取已知含量的同一批样品6 份（1 号样），每份0.25 g，按1 ∶1 的比例加入相应量的对照品，依法制备供试品溶液，测定含量，计算回收率。结果见表1。

2.4 样品含量测定

因是单味药材，空白试剂无干扰，仅提供样品的测定图谱，详见图1。含量测定结果见表2。

3 讨论

3.1 测定方法选择

采用普通的色谱仪、等度洗脱，以乙腈－甲醇－0.1%磷酸溶液（49 ∶7 ∶44，V／ V／ V）为流动相，在（222±1）nm波长处同时测定决明子药材中橙黄决明素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量，各波峰分离度符合要求，进样1 针，35 min 出峰完毕。一台普通液相色谱仪即可完成测定，试验成本降低，普及范围大。

表1 加样回收试验结果（ n ＝6）

图1 高效液相色谱图

表2 决明子4 种成分含量测定结果（mg／g）

3.2 供试品溶液前处理程度改进

2015年版《中国药典》中需甲醇加热回流提取，取适量提取液蒸干、残渣再加稀盐酸水解，水解液用三氯甲烷萃取4 次，萃取液再蒸干，用溶剂定容。粗略地计算，处理1 批样品需有机溶剂195 mL，耗时5 ～6 h，费时费力，且严重污染环境。以无浓缩、萃取、蒸干的环保方法，取代了甲醇提取、提取液蒸干、水溶解、三氯甲烷萃取、萃取液再蒸干、有机溶剂定容的传统方法，效率提高、时间缩短、环境污染降低，精密度和准确度提升。

3.3 流动相等度洗脱程序选择

目前，决明子或其制剂的含量测定中多数是测定橙黄决明素和大黄酚含量[8－11]，也有测定橙黄决明素、大黄素、大黄酚含量的[12]，还有测定橙黄决明素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量的[12－13]，最多测定到12 种蒽醌类成分[14]，均为梯度洗脱，除采用超高效液相色谱法，特定的超高效液相色谱柱出峰时间在4 min[12]（但波峰分离不佳，尤其是样品中大黄素波峰保留时间与对照品相差较大）内外，其余测定4 种成分的梯度洗脱时间多设定为40 min 以上。