高效液相色谱法测定复方斑蝥胶囊中4 种活性成分含量

白 宏，何光照

（江苏省常州市第四人民医院药剂科，江苏 常州 213032）

复方斑蝥胶囊是以斑蝥、人参、黄芪、刺五加、三棱、半枝莲、莪术、山茱萸、女贞子、熊胆粉、甘草等药材经煎煮等工序加工制成的中成药，具有破血消瘀、攻毒蚀疮之功效，临床主要用于治疗原发性肝癌、肺癌、直肠癌、恶性淋巴瘤、妇科恶性肿瘤[1－3]。方中刺五加益气健脾、补肾安神[4－5]，山茱萸补益肝肾、收涩固脱[6－7]，女贞子滋补肝肾、明目乌发[8－9]，甘草补脾益气、清热解毒[10－11]。复方斑蝥胶囊收载于《卫生部药品标准·中药成方制剂（第十七册）》（WS3－B－3272－98），标准中仅有性状、鉴别、检查项，无针对方中中药成分的含量测定项；加强对复方斑蝥胶囊药物的质量控制，可有效保障广大人民群众的用药安全，遏制不法分子制假、贩假行为[12－13]。本研究中采用高效液相色谱（HPLC）法同时检测复方斑蝥胶囊中马钱苷、特女贞苷、紫丁香苷和甘草苷4 种活性成分含量。现报道如下。QUINTIX2102－1CN 型电子分析天平（德国赛多利斯公司，精度为十万分之一）；UV－8000A 型双光束紫外可见分光光度计（上海元析仪器公司）；Milli－Q IQ 7000 型超纯水仪（美国密理博公司）；KQ2200ES 型超声波清洗器（昆山超声设备公司，功率为500 W，频率为100 kHz）。

1 仪器与试药

仪器：安捷伦1260 型高效液相色谱仪，配备G1311C型四元泵、G1329B 型自动进样器、G1316A 型柱温箱和G1314F 型紫外检测器（美国安捷伦公司）；Sartorius

试药：马钱苷对照品（批号为111640－201808，含量为99.0% ），特女贞苷对照品（批号为111926－201605，含量为93.3% ），紫丁香苷对照品（批号为111574－201605，含量为95.2%），甘草苷对照品（批号为111610－201106，含量为93.7%），均购自中国食品药品检定研究院；复方斑蝥胶囊（陕西华西制药股份有限公司，国药准字Z20003270，批号分别为180924，190106，190417，规格为每粒0.25 g）；甲醇、乙腈均为色谱纯（德国Merck 公司）；磷酸（分析纯，国药集团上海化学试剂厂）；纯化水（自制）；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax Eclispe Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，3.5 μm）；检测波长：235 nm；流速：1.0 mL／min；柱温：25 ℃；进样量：10 μL；流动相：乙腈（A） －0.3%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0 ～8 min 时5%A，8 ～15 min 时5% ～23%A，15 ～28 min 时23% ～73%A，28 ～29 min时73% ～5%A，29 ～35 min 时5%A）。

图1 高效液相色谱图

2.2 溶液配制

混合对照品贮备溶液：取马钱苷、特女贞苷、紫丁香苷、甘草苷对照品适量，精密称定，置25 mL 容量瓶中，制备每1 mL 溶液中含马钱苷0.5 mg、特女贞苷2.5 mg、紫丁香苷0.8 mg、甘草苷2.0 mg 的混合溶液，加85%甲醇20 mL 使溶解，定容至刻度，摇匀，即得。

对照品溶液：精密量取混合对照品贮备溶液2.0 mL，置20 mL 容量瓶中，加85%甲醇定容至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液：取样品20 粒，倒出内容物，混匀，取约1.0 g，精密称定，置25 mL 容量瓶中，加85%甲醇20 mL，超声提取25 min（超声功率为300 W，频率为25 kHz），放冷，加85%甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液：按处方分别制备缺刺五加、山茱萸、女贞子、甘草的阴性样品，以及缺待测成分对应药材的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：分别取试剂空白溶液及2.2 项下对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液，按拟订色谱条件进样分析，记录色谱图。结果阴性对照品溶液色谱图中，在4 种待测成分马钱苷、紫丁香苷、甘草苷、特女贞苷对应色谱峰位置无杂质干扰，4 种待测成分分离度均符合《中国药典》要求。色谱图见图1。

线性关系考察：取2.2 项下混合对照品贮备溶液适量，稀释制成系列标准曲线溶液，分别置20 mL 容量瓶中，加85%甲醇定容至刻度，摇匀，按拟订色谱条件设置仪器参数，稳定后分别进样分析，记录色谱图；以质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程。结果见表1。

表1 4 种活性成分线性范围、回归方程及相关系数

精密度试验：取2.2 项下对照品溶液，按拟订色谱条件进样分析，记录色谱图，结果马钱苷、紫丁香苷、甘草苷、特女贞苷峰面积的RSD分别为1.34%，1.42%，1.19%，0.94%（n ＝6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取样品（批号为180924）20 粒，倒出内容物，混匀，取约1.0 g，精密称定，共6 份，分别置25 mL容量瓶中，依法制备供试品溶液；按拟订色谱条件进样分析，记录色谱图，计算含量。结果马钱苷、紫丁香苷、甘草苷和特女贞苷含量的RSD分别为2.08%，2.81%，3.39%，1.93%（n ＝6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取样品（批号为180924），按2.2 项下方法制备供试品溶液，室温下放置0，3，6，9，12，24 h，按拟订色谱条件进样分析，记录色谱图。结果马钱苷、紫丁香苷、甘草苷和特女贞苷峰面积的RSD分别为1.48%，2.03%，1.82%，1.08%（n ＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为180924）20 粒，倒出内容物，混匀，取约1.0 g，精密称定，共6 份，分别置25 mL 容量瓶中；加入2.2 项下混合对照品贮备溶液适量，依法制备供试品溶液；按拟订色谱条件进样分析，记录色谱图，计算回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n ＝6）

2.4 样品含量测定

取样品（批号分别为180924，190106，190417），依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样分析，记录色谱图，根据峰面积计算含量。结果见表3。

表3 3 批样品中4 种活性成分含量测定结果（mg／g）

3 讨论

3.1 活性成分选择

考察复方斑蝥胶囊中刺五加、山茱萸、甘草、女贞子4 味药材的指标性成分，即紫丁香苷、马钱苷、甘草苷和特女贞苷，基本覆盖了复方斑蝥胶囊组方中的君臣佐使，能全面地反映其质量。

3.2 提取方法优化

试验分别优化了提取溶剂的用量（15，18，20，22 mL）、超声时间（15，20，25，30 min）和功率（250，300，350 W）。结果表明，选择85% 甲醇提取溶剂用量为20 mL、超声时间25 min 和超声功率300 W 时，提取效率最好，且杂质无干扰。

3.3 检测波长选择

分别配制5 μg／mL 的紫丁香苷、马钱苷、甘草苷和特女贞苷单标对照品溶液，于190 ～400 nm 波长间进行波谱扫描，记录光谱图。结果紫丁香苷在262 nm 波长处、马钱苷在241 nm 波长处、甘草苷在237 nm 波长处、特女贞苷在225 nm 波长处具有最大吸收。表明选择235 nm 作为检测波长时，4 种活性成分响应情况良好，定性、定量结果准确。

3.4 方法评价

本研究中建立的HPLC 检测复方斑蝥胶囊中4 种活性成分马钱苷、特女贞苷、紫丁香苷、甘草苷的含量，简便快速，重复性好，结果准确，可用于复方斑蝥胶囊的质量控制。