高效液相色谱法同时测定养血当归糖浆中芍药苷和甘草酸铵含量

余中霞，方菲菲，张继红，何亚芬

（江西省上饶市食品药品检验检测中心，江西 上饶 334000）

养血当归糖浆是由当归、白芍、熟地黄、茯苓、甘草、 党参、黄芪、川芎8 味中药组方的成方制剂，收录于《卫生部药品标准·中药成方制剂（第二册）》（WS3－B－0358－90），具有补气血、调经功效，临床常用于治疗行经腹痛、月经不调、贫血虚弱、产后体虚、产后血虚、萎黄肌瘦等症。现行质量标准项下尚未收录其含量测定指标和方法。有研究以主药当归和白芍中主要成分阿魏酸和芍药苷为指标成分建立含量测定方法，以及对主要成分当归、川芎、黄芪建立薄层色谱鉴别方法[1－2]。鉴于中药成方制剂成分的复杂多样性，少数成分难以全面评价和反映药物的内在质量。且复方中甘草具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药的功效，是养血当归糖浆制剂发挥药效的主要臣药，其主要成分为甘草苷和甘草酸[3－5]。本研究中以白芍中的芍药苷、甘草中的甘草酸铵为指标成分，建立了测定养血当归糖浆中芍药苷和甘草酸铵含量的高效液相色谱（HPLC）法，为进一步提高和完善养血当归糖浆的质量标准提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司），包括Waters 2998PDA 检测器，Empower3 工作站；BP211D 型电子天平（德国Sartoriu，精度为十万分之一）；色谱柱：Kromasil－C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，迪马公司）；Bcf－20L 型数控超声清洗器（上海比朗仪器制造有限公司，功率为100 W，频率为40 kHz）；A3s－10－10CE 型超纯水机（美国艾科浦国际有限公司）。

1.2 试药

甘草酸铵对照品（批号为110731－201619），芍药苷对照品（批号为110736－200408），均购自中国食品药品检定研究院，纯度均不低于98%；养血当归糖浆（批号分别为170601，170506，江西盛翔制药有限公司；批号171205，180504，180903，江西药都樟树制药有限公司；批号为20161202，广西壮族自治区花红药业股份有限公司；批号为170602，福寿堂制药有限公司）；乙醇（分析纯，上海展云化工有限公司）；乙腈（色谱纯，美国Fisher 公司）；磷酸（色谱纯，上海展云化工有限公司）；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil－C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈－0.085%磷酸溶液，洗脱梯度程序见表1；检测波长：230 nm；流速：1.0 mL／min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

表1 流动相梯度洗脱程序（% ）

2.2 溶液制备

混合对照品溶液：取芍药苷对照品10.49 mg、甘草酸铵对照品18.45 mg，精密称定，置50 mL 棕色容量瓶中，加70%乙醇适量溶解并定容至刻度，混匀，即得。

供试品溶液：精密量取样品6 mL，置10 mL 棕色容量瓶中，加入70%乙醇适量，密塞，超声提取20 min（功率为40 W，频率为50 Hz），放冷，再用上述溶液补至刻度，摇匀，离心30 min（转速为4 000 r ／ min，功率为25 W），取上清液，过滤，滤液用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液：按该制剂注册标准的处方和制备工艺制备缺白芍和甘草的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液，摇匀，即得。

2.3 方法学考察

专属性试验：分别精密吸取上述3 种溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，按拟订色谱条件分析，色谱图见图1。结果被测成分能达到完全分离，阴性对照无干扰。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察：精密吸取混合对照品溶液1，2，3，4，5 mL，分别置25 mL 容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，按拟订色谱条件进样测定。以质量浓度（X）为横坐标、峰面积值（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y芍＝11 929X＋19 597（r＝0.999 2）和Y甘＝3 654X－10 667（r＝0.999 2）。结果表明，芍药苷和甘草酸铵质量浓度分别在5.54 ～55.35 μg／mL 和9.63 ～115.56 μg／mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密量取同一混合对照溶液10 μL，重复进样6 次，分别测定其峰面积并计算含量。结果芍药苷和甘草酸铵的RSD分别为0.21%和0.16%（n ＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同批（批号为170601）样品，依法制备供试品溶液，室温放置，分别于0，2，4，8，12，24 h 时进样10 μL，测定峰面积并计算含量。结果芍药苷和甘草酸铵含量的RSD分别为0.49%和0.56% （n＝6），表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

重复性试验：取同批（批号为170601）样品，依法制备供试品溶液6 份，测定峰面积并计算含量。结果芍药苷和甘草酸铵含量的RSD分别为0.62% 和0.54%（n ＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密量取6 mL 同批（批号为170601）样品，分别置10 mL 容量瓶中，平行6 份，分别精密加入一定质量浓度的对照品溶液，依法制备供试品溶液。按拟订色谱条件进样测定，按外标法计算回收率。结果见表2。

2.4 样品含量测定

取不同批次样品，每个批次平行3 份，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定。结果见表3。

表2 加样回收试验结果（n ＝6）

表3 7 批样品含量测定结果（mg／mL，n ＝3）

3 讨论

3.1 提取条件选择

采用单因素分析法，比较了不同提取方法（加热回流、冷浸提取、超声提取）、不同提取溶剂（甲醇、乙醇、乙酸乙酯）、不同提取体积分数（甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇）、不同提取时间（15，30，45，60 min）的提取效果。结果表明，以70%乙醇溶液超声提取30 min 提取最完全，所测含量最高，且操作简单便捷、环保安全。

3.2 流动相选择

有机相比较了甲醇和乙腈，结果在相同色谱条件下，以乙腈为有机相，目标化合物能获得更好分离。水相比较了0.1%磷酸溶液和0.085%磷酸溶液，结果表明，以0.085%磷酸溶液为水相，目标化合物色谱峰出峰时间适宜且分离度和峰形均明显优于0.1%磷酸溶液。

3.3 检测波长选择[6 －7]

比较了316，250，230 nm 波长下芍药苷和甘草酸铵的检测情况，结果表明，以316 nm 为检测波长时，无法检测到甘草酸铵；以250 nm 为吸收波长时，2 种物质未达到最大吸收峰；以230 nm 为检测波长时，2 种物质均有吸收峰，峰面积值最大，故选择230 nm 为检测波长。

3.4 结果分析

通过方法学考察，本试验中所建立的方法稳定准确、简便易行，可为进一步制订和完善养血当归糖浆的质量标准提供依据。不同厂家和不同批次的制剂含量测定结果表明，养血当归糖浆中芍药苷和甘草酸铵的含量稳定，表明制剂工艺稳定，药材来源可靠。