3，5－二硝基水杨酸法测定蔓菁中还原糖和总糖含量*

高文军，李卫红，王喜明，乔丽芳

（山西省医药与生命科学研究院，山西 太原 030006）

蔓菁Brassica rapaL. 为十字花科芸薹属植物蔓菁的根，具有开胃消食、下气宽中、止咳化痰、利湿解毒、温和脾胃之功效[1]。其根富含多种糖类[2－3]、有机酸、甾体、三萜、生物碱[4]等化合物，以及核黄素、烟酸、维生素C及钙、磷、铁[5]等无机元素，具有抗缺氧、提高免疫力[6]、抗辐射、滋补等功效。蔓菁在新疆、西藏、四川、陕西、山西等地多有种植。《食疗本草》《本草纲目》《千金方》《本草从新》《名医别录》《药物宝库》等古代文献均有记载，其中《本草纲目》有“辛、苦、平，无毒，可升可降，能汗能吐，能下能利小便，又能明目解毒，其效甚伟”的描述。蔓菁的藏药名为“妞玛”，具有解毒、滋补功效，主治各种中毒症、“龙”病、身体虚弱等；维吾尔族名为“恰玛古”，是维吾尔族人喜爱并有较长历史的药食同源之品，且以藏药、维药的形式收载于卫生部药品标准中[7]。山西晋南地区出产的蔓菁应用广泛，在当地已有上百年的食用历史，其形似人参，在当地有“小人参”之称。对其物质基础的研究有助于进一步开发利用该产品，为当地蔓菁资源的利用提供依据。目前，仅对晋南蔓菁化学成分分析及蛋白质含量测定有报道[8]，此外未见其他文献对晋南蔓菁有研究。晋南蔓菁多糖含量较多，而植物多糖具有免疫调节、抗疲劳、抗氧化、降血糖等作用[9]。为此，本研究中建立了测定晋南蔓菁中糖含量的方法，为蔓菁的产品开发提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Biomate 3S 型紫外可见分光光度计（Thermo Fisher公司）；AUW220D 型电子天平（Shimadzu 公司，精度为十万分之一）；WB－4 型恒温水浴锅（常州峥嵘仪器有限公司）；SB－500DTY 型超声波多频清洗机（宁波新芝生物科技有限公司）；XF－100 型粉碎机（江苏杰瑞尔电器有限公司）；Vortex－2 型涡旋混匀仪（上海沪析实业有限公司）。

1.2 试药

蔓菁（采自山西运城，批号分别为20181220，20181230，20190105）；D－无水葡萄糖（中国食品药品检定研究院，批号为110833－201205，含量不低于99.5%）；盐酸（国药集团化学试剂有限公司），3，5－二硝基水杨酸（上海科丰化学试剂有限公司），苯酚（天津市申泰化学试剂有限公司），均为分析纯；DNS 试剂（将6.9 g 结晶重蒸馏酚溶于15.2 mL 10%氢氧化钠溶液中，稀释至69 mL 后加入6.9 g 亚硫酸氢钠，作为A 液；将255 g 酒石酸钾钠加入300 mL 10%氢氧化钠溶液中，再加入880 mL 1%3，5－二硝基水杨酸溶液，作为B 液；将A液、B 液混合，得黄色溶液，贮于棕色瓶中备用，常温下放置1 周后使用[10]）；其他试剂均为分析纯，水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

对照品贮备溶液：精密称取D－无水葡萄糖对照品8.53 mg，用水溶解并定容至10 mL 容量瓶中，摇匀，作为对照品贮备溶液（质量浓度为0.849 mg／mL）。

还原糖供试品溶液：取样品粉末（过20 目筛）约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入蒸馏水25 mL，密塞，称定质量，超声处理20 min，取出，放至室温，再称定质量，补足减失质量，摇匀，滤过，即得。

总糖供试品溶液：取样品粉末（过20 目筛）约0.1 g，精密称定，置具塞刻度大试管中，加6 mol／L 盐酸10 mL，沸水浴水解10 min，取出，流水冷却至室温，用40%氢氧化钠溶液调至中性，加蒸馏水至25 mL，摇匀，过滤，精密移取滤液1 mL 置5 mL 容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得。

2.2 样品含量测定方法

精密量取以上还原糖供试品溶液、总糖供试品溶液各2 mL，置25 mL 具塞刻度大试管中，空白对照组加蒸馏水至2 mL，各加入2 mL DNS 试剂，摇匀，90 ℃水浴显色6 min，取出，流水冷却至室温，加水至25 mL，摇匀，于540 nm 波长处检测吸光度。

2.3 检测条件确定

检测波长：采用DNS 法测定时波长的选择方法不一，但多集中在400 ～800 nm[11－13]。考虑到显色剂、紫外分光光度计相关因素的影响，本研究中对DNS 法测定还原糖含量的最佳波长进行了筛选，在400 ～800 nm 波长范围内对试验样品进行了扫描。精密量取稀释的对照品贮备溶液和蒸馏水各2.0 mL，分别置25 mL 具塞试管中，各加入2 mL DNS 试剂，摇匀，90 ℃水浴加热6 min，迅速冷却，加水定容至25 mL，分别于400 ～800 nm 波长范围内对葡萄糖显色液（以蒸馏水为空白对照）、DNS试剂（以蒸馏水为空白对照）、葡萄糖显色液（以DNS 试剂为空白对照），确定检测波长。结果见图1。可见，葡萄糖显色液（以DNS 试剂为空白对照）曲线最大吸收峰处的波长为490 nm，但在此波长下DNS 也具有一定的吸光度，选择490 nm 波长对样品的测定干扰较大。由另外2 条曲线可见，DNS 试剂以水为空白对照时，在低波长处自身的吸收较明显，但随着波长的增大吸收越来越小，当波长不短于540 nm 时，葡萄糖显色液（以DNS 试剂为空白对照）曲线和葡萄糖显色液（以蒸馏水为空白对照）曲线近乎重合。可见，当波长不短于540 nm 时，DNS 试剂自身的吸收对葡萄糖显色液的干扰可忽略，故将540 nm 作为检测波长。

图1 葡萄糖溶液吸收光谱图

显色剂用量：分别精密量取2 mL 还原糖供试品溶液，置编号为1 ～6 号的25 mL 具塞试管中，分别加入0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL DNS 试剂，沸水浴中加热10 min，迅速冷却，用蒸馏水定容至25 mL，在540 nm波长下测定吸光度。结果见图2 A。可见，当DNS 试剂用量为2mL 时，用量继续增加，吸光度浮动较小。为了减小DNS 试剂对吸光度测定的影响，用量不应小于2.0 mL，故本试验中DNS 试剂用量选择2.0 mL。

显色时间：分别精密量取2 mL 还原糖供试品溶液，置编号为1 ～5 号的25 mL 具塞试管中，分别加入2.0 mL DNS 试剂，沸水浴分别加热4，6，8，10，12 min，迅速冷却，用蒸馏水定容至25 mL，在540 nm 波长下测定吸光度。结果见图2 B。可见，沸水浴显色4，6，8，10，12 min 时的吸光度变化不明显，较稳定；当显色时间长于4 min 时，显色时间对于试验的影响不明显。考虑到4 min 时间过于短暂，显色时间过短操作较局促，故本试验中最终选择6 min 为显色时间。

显色温度：分别精密量取2 mL 还原糖供试品溶液5 份，置编号为1 ～5 号的25 mL 具塞试管中，分别加入2.0 mL DNS 试剂，分别在60，70，80，90，100 ℃水浴中加热6 min，迅速冷却，用蒸馏水定容至25 mL，在540 nm 波长下测定吸光度。结果见图2 C。可见，显色温度达90 ℃时，结果趋于稳定，故本试验中选择90 ℃为显色温度。

总糖水解时间：分别取蔓菁粉末（过20 目筛）6 份，每份约0.1 g，精密称定，置编号为1 ～5 号的具塞刻度大试管中，加6 mol ／ L 盐酸10 mL，分别沸水浴水解5，10，20，30，40 min，取出，流水冷却至室温，用40%氢氧化钠溶液调至中性，加水至25 mL，摇匀，过滤，精密量取滤液1 mL，置5 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，即得总糖供试品溶液，按拟订检测方法测定。结果见图2 D。可见，水解时间为10 min 时吸光度最高，10 min 后吸光度开始下降，趋势图同文献[14]报道一致，猜测可能水解液又发生了新的反应，故本试验中选择10 min 为总糖的水解时间。

2.4 方法学考察

标准曲线绘制：分别精密吸取对照品贮备溶液0.25，0.50，1.00，2.00，3.00 mL，置5 mL 容量瓶中，蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得系列质量浓度溶液。精密量取对照品溶液2 mL，置具塞刻度大试管中，加入2 mL DNS 试剂，摇匀，90 ℃水浴显色6 min，取出，流水冷却至室温，加水至25 mL，摇匀，在540 nm 波长处检测吸光度。以质量浓度（C，mg／mL）为横坐标、吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程A＝1.112 7C＋0.019 1，r＝0.998 9（n＝5）。结果表明，葡萄糖质量浓度在0.042 45 ～0.509 4 mg／mL 范围内与吸光度线性关系良好。

图2 检测条件考察结果

精密度试验：分别取蔓菁原料的还原糖、总糖供试样品溶液，按样品测试方法连续测定6 次，记录吸光度。结果还原糖的吸光度分别为0.300 4，0.300 4，0.300 4，0.300 5，0.300 5，0.300 5，总糖的吸光度分别为0405 6，0.405 7，0.405 3，0.405 2，0.405 6，0.406 1，还原糖和总糖的RSD分别为0.02%和0.08%（n ＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：分别取蔓菁原料的还原糖、总糖供试样品溶液，按样品测定方法测定，显色反应完成后，每隔10 min 测定1 次。结果见表1，表明样品在50 min 内稳定性良好。

重复性试验：分别制备6 份蔓菁原料的还原糖、总糖供试品溶液，按样品测试方法测定，记录吸光度，并计算含量。结果还原糖平均含量为6.29% 、RSD为1.13% （n ＝6），总 糖 平 均 含量 为44.51% 、RSD为2.06%（n ＝6），表明方法重复性良好。

表1 稳定性试验结果（ n ＝6）

加样回收试验：分别称取6 份还原糖、总糖蔓菁样品，每份约0.05 g，精密称定，分别准确加入无水葡萄糖对照品适量，依法制备供试品溶液，按拟订样品测试方法测定，记录吸光度，并计算含量。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n ＝6）

2.5 样品含量测定

取3 批次样品，按拟订样品测定方法测定还原糖和总糖含量，根据葡萄糖标准曲线，分别计算蔓菁样品中还原糖和总糖含量。结果见表3。可见，晋南蔓菁还原糖和总糖的百分含量分别为5.86% ～6.93%，44.65% ～46.50%，还原糖和总糖含量均较高。由于糖类成分在晋南蔓菁中占比较高，不同的糖对人体有重要的生理作用，为下一步研究糖的组成和活性奠定了基础。

表3 3 批样品含量测定结果（%）

3 讨论

测定样品中糖的含量经常采用的方法有苯酚－硫酸法[15]、蒽酮－硫酸法[16]、3，5－二硝基水杨酸（DNS）法[17]，但前2 种方法用的硫酸腐蚀性较强，会造成一定的安全隐患。另外，前2 种方法不能对样品中单糖进行测定，有一定局限性。DNS 法是半微量定糖法[18]，该方法操作简单、便捷、杂质干扰较少，便于批量测定，是一种常用方法。该方法的原理是在碱性条件下，还原糖将3，5－二硝基水杨酸中的硝基还原成氨基，生成橘红色化合物，在一定范围内，还原糖含量与颜色成正比。本研究中同时考察了DNS 试剂用量、显色温度和反应时间，保证了反应的可靠性。经方法学考察，DNS 法重复性好、操作简便、快速、准确、灵敏，可用于测定晋南蔓菁中多糖的含量。