均匀设计结合药效学优选酸枣仁复方提取工艺

李 建，朱 杰，全彦涛，于立芹，张华南

（1. 河南省生物技术开发中心，河南 郑州 450002； 2. 河南省植物天然产物开发工程技术研究中心，河南 郑州 450002）

酸枣仁复方是河南省生物技术开发中心实验室从临床治疗失眠症经方中筛选出的，以酸枣仁、百合、茯苓、大枣等组成的，具有镇静催眠功效的药食两用中药复方。复方中君药酸枣仁味酸、甘，性平，具有养心益肝、安神、敛汗之功效，为治疗心肝血虚之心悸、失眠要药[1]，占比最高；百合具有润肺止咳、宁心安神功效；茯苓具有渗湿利尿、宁心安神功效，可治疗心脾两虚、心肾不交之失眠诸证[2]；大枣具有补中益气、养血安神之功效。中药复方药效的影响因素众多，提取方法为重要因素。《医学源流论》曰：“煎药之法，最宜深讲，药之效不效，全在乎此。”中药方剂传统提取方法多为水煎，而现代研究多认为高体积分数的乙醇对活性成分提取率较高[3]。为达到最佳药效，本试验中以延长戊巴比妥诱导小鼠睡眠时间为考察指标，通过均匀设计法优选酸枣仁复方的提取工艺，为其工业生产和临床应用提供参考。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与动物

仪 器：CP224C 型 电 子 天 平（精 度 为0.1 mg），STX220 型便携式天平（精度为0.1 g），均购自奥豪斯仪器＜上海＞有限公司；SB2100 型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）。

试药：百乐眠胶囊（扬子江药业集团有限公司，批号为17032841）；戊巴比妥钠（上海西唐生物科技有限公司，德国进口分装，纯度大于99%，批号为20170527）；炒酸枣仁为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujubaMill.var.Spinosae （Bunge）Hu ex H.F.Chou 的干燥成熟种子（产自广西），百合为百合科植物卷丹Lilium lancifoliumThunb、百合Lilium browniiF.E.Brown var.viridulum Baker或细叶百合L.pumilum DC. 的干燥肉质鳞茎（产自浙江），茯苓为多孔菌科真菌Wolfiporiacocos（Schwein.）的干燥菌核（产自云南），大枣为鼠李科植物枣Ziziphus jujubaMill. 的干燥成熟果实（产自河南），均购自河南省世通医药有限公司，经河南省生物技术开发中心赵天增研究员鉴定为正品，经检测均符合2015年版《中国药典（一部）》相关项下要求。

动物：SPF 级雌性昆明种小鼠80 只，体质量为18 ～22 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号为SCXK（湘）2016－0002。自由饮水和摄食，12 h 昼夜节律变换，相对湿度为50% ～70%，温度为（23±1）℃。试验过程均符合动物伦理学要求。

1.2 方法

1.2.1 组方设计与提取

采用均匀设计法，选用U*6（64）均匀设计表，以乙醇体积分数（因素A）、溶剂用量（因素B）、提取时间（因素C）为考察因素，每因素设置6 个水平，共有6 种提取工艺组合，各水平提取工艺见表1。复方中酸枣仁、百合、茯苓、大枣比例为50 ∶27 ∶19 ∶13。按此比例，准确称量各药材，将各药材混合，按均匀设计表工艺提取，提取次数均为2 次，过滤后合并滤液，旋转蒸发，干燥，计算干膏得率。

表1 提取工艺均匀试验设计

1.2.2 动物分组与给药

将小鼠随机分为8 组，分别为组方1 组至组方6组、空白对照组、百乐眠胶囊组，每组10 只。组方1 组至组方6 组根据干膏得率折算小鼠给药剂量，分别为1.26，1.35，1.11，1.15，0.85，1.08 g／kg，百乐眠胶囊给药剂量为0.31 g／kg。各组药物以0.5%CMC－Na 溶液配制，空白对照组灌胃0.5%CMC－Na 溶液。各组小鼠灌胃溶液体积均为10 mL／kg。

1.2.3 药效学试验

自主活动试验：小鼠连续灌胃15 d。试验第1 周、第2 周分别进行小鼠自主活动测试。测试前1 d 禁食16 h。给药30 min 后，将小鼠置纸箱内，使其适应2 min 后，记录后5 min 内活动次数（爬行格数）、站立次数（双前肢向上抬举次数）和理毛次数。

直接睡眠试验：小鼠连续灌胃15 d，观察给药后是否出现睡眠现象。睡眠以翻正反射消失为指标。当小鼠置于背卧位时，能立即翻正身位。如超过30 ～60 s 不能翻正者，即认为翻正反射消失，进入睡眠。翻正反射恢复即为动物觉醒，翻正反射消失至恢复这段时间为动物睡眠时间。记录空白对照组与各给药组入睡动物数。

延长戊巴比妥钠诱导睡眠时间试验：小鼠连续灌胃15 d。试验前1 d 禁食16 h。给药后30 min，各组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠60 mg／kg，注射溶液量为10 mL／kg，以翻正反射消失为指标，观察各药物能否延长戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间。以翻正反射消失至恢复这段时间计为睡眠时间。

戊巴比妥钠阈下剂量催眠试验：小鼠连续灌胃15 d。试验前1 d 禁食16 h。给药后30 min，各组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠最大阈下催眠剂量40 mg／kg，记录30 min内入睡动物数（翻正反射消失达1 min 以上者）。

1.3 统计学处理

采用SPSS 16.0 统计学软件分析。计量资料以表示，经正态分布检验后进行比较，各组间比较采用单因素方差分析。P ＜0.05 为差异有统计学意义。相关性分析采用Pearson 法。均匀试验设计的提取工艺优化采用DPS 多元回归分析，得回归方程与最优解。

2 结果

2.1 干膏得率

根据均匀设计试验条件进行复方提取，组方1 至组方6 的 干 膏 得 率 分 别 为22.3% ，23.9% ，19.5% ，20.3%，14.9%，19.1%。可见，不同提取条件下干膏得率差异较大。

2.2 药效学试验结果

表2 各组小鼠体质量比较（±s，g，n ＝10）

表2 各组小鼠体质量比较（±s，g，n ＝10）

组别试验开始前试验第1 周试验结束时组方1 组组方2 组组方3 组组方4 组组方5 组组方6 组空白对照组百乐眠组21.7 ±0.30 21.7 ±0.30 21.7 ±0.42 21.7 ±0.30 21.7 ±0.30 21.7 ±0.30 21.8 ±0.32 21.9 ±0.74 30.2 ±2.10 29.9 ±2.28 31.1 ±3.07 30.9 ±1.54 30.7 ±2.34 31.4 ±1.90 30.4 ±1.74 31.1 ±2.17 34.1 ±1.55 33.4 ±2.74 35.6 ±3.92 34.8 ±1.79 33.6 ±3.89 35.7 ±3.09 35.1 ±1.76 36.4 ±3.11

体质量：在试验开始前及试验第1 周、试验结束时分别对小鼠体质量进行分析，结果见表2。各给药组小鼠初始体质量与空白对照组相比无显著差异（P ＞0.05），即各组小鼠的初始体质量较均衡；试验第1 周及试验结束时，各给药组小鼠体质量与空白对照组相比均无显著差异（P ＞0.05）。结果表明，各受试药物对小鼠体质量增长无影响。

自主活动：结果见表3。给药1 周后，与空白对照组相比，各组小鼠活动次数及站立次数均有下降，其中组方3 组小鼠活动次数与空白对照组相比下降显著（P＝0.046）；组方1 组至组方3 组及百乐眠组小鼠站立次数与空白对照组相比下降显著（P＝0.035，0.024，0.044，0.049）。给药2 周后，除组方4 组外，其他各组小鼠活动次数与第1 周相比均有下降，其中组方1 组、组方3 组及百乐眠组小鼠活动次数与空白对照组相比下降显著（P＝0.040，0.033，0.021），组方1 组至组方3 组小鼠站立次数与空白对照组相比下降显著（P＝0.022，0.033，0.034）。给药第1 周与第2 周，各组小鼠理毛次数与空白对照组相比均无显著差异。

表3 各组小鼠自主活动情况比较（±s，次，n ＝10）

表3 各组小鼠自主活动情况比较（±s，次，n ＝10）

注：与空白对照组比较，▲P ＜0.05。

组方1 组组方2 组组方3 组组方4 组组方5 组组方6 组空白对照组百乐眠组第1 周47.3±18.5 46.7±25.1 42.7±30.9▲56.3±24.1 58.2±37.3 57.9±20.3 69.1±36.4 43.5±21.2第2 周41.8±20.6▲46.2±20.4 41.0±18.9▲66.9±22.8 46.8±27.0 54.3±22.5 62.2±13.5 37.9±13.4▲第1 周13.2±7.7▲12.2±13.4▲13.9±15.7▲19.7±13.8 21.0±19.2 19.4±11.5 27.6±18.5 13.5±9.0▲第2 周11.6±9.2▲12.2±12.8▲12.6±8.8▲29.0±18.3 14.9±14.8 18.0±11.2 24.8±8.1 13.5±6.6第1 周2.9±2.0 2.0±1.0 2.3±0.8 2.1±1.0 2.1±1.9 2.9±1.3 1.9±0.6 2.2±1.6第2 周1.9±1.6 1.7±1.1 2.1±1.4 2.7±1.3 2.6±1.7 2.6±1.1 2.0±0.9 1.6±1.4活动 站立 理毛组别

直接睡眠作用：各组小鼠给药后，观察60 min 内小鼠活动情况，给药组与空白对照组均无睡眠现象发生，小鼠活动正常，表明各药物及百乐眠胶囊均无直接睡眠作用。

延长戊巴比妥钠诱导睡眠时间：结果见表4。可见，与空白对照组比较，组方2 组、4 组、6 组小鼠睡眠时间相近。组方5 组小鼠睡眠时间有所延长，但无显著差异。组方1 组、组方3 组及百乐眠组小鼠睡眠时间显著延长（P＝0.006，0.044，0.048），表明这些提取工艺条件有助于促进睡眠。

表4 各组小鼠延长戊巴比妥钠诱导睡眠时间比较（±s，min，n ＝10）

表4 各组小鼠延长戊巴比妥钠诱导睡眠时间比较（±s，min，n ＝10）

注：与空白对照组比较，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01。

组别组方1 组组方2 组组方3 组组方4 组睡眠时间114.93±38.19▲▲60.35±25.48 100.75±44.23▲62.59±28.29组别组方5 组组方6 组空白对照组百乐眠组睡眠时间89.18 ±40.63 69.90 ±15.07 67.77 ±36.84 100.17 ±28.67▲

对戊巴比妥钠阈下剂量催眠效果：结果见表5。可见，各受试药物均可增加阈下催眠剂量戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠只数，表明组方1 至6 提取物与戊巴比妥钠可能产生协同作用。

表5 各组小鼠戊巴比妥钠阈下剂量催眠发生率比较（%，n ＝10）

2.3 多元回归处理与相关性分析

采用DPS 软件处理睡眠时间，经多元回归得回归方程Y＝67.29 ＋1.34X3－0.009 5X3X3＋0.005 9X1X2－0.008 8X1X3，R＝1.000 0，F＝4 600.345 9，回归显著性检验P＝0.011 1，表明该方程能较好地拟合各提取工艺对睡眠时间产生的影响。优化结果为乙醇体积分数0、溶剂用量10 倍、超声时间71 min。将组方1 组至组方6组小鼠睡眠时间与干膏得率进行Pearson 相关性分析，R＝－0.145，P＝0.785，差异无统计学意义。

2.4 验证试验

为进一步考察优选工艺的可靠性，按最佳提取工艺进行验证试验，操作方法同前。优化工艺连续灌胃15 d后平均延长戊巴比妥钠诱导睡眠时间为（116.0±24.53）min，显著高于空白对照组的（62.32±35.28）min与百乐眠组的（92.18±30.40）min（P＝0.000），表明其具有镇静催眠作用，且药效显著优于百乐眠胶囊。验证结果与优选试验结果相当，表明该优选工艺稳定、可行。

3 讨论

中药复方以多成分多靶点作用于人体，各组分按一定比例组成了中药复方的整体。在复方提取过程中，不同提取方法得到的有效成分的比例和含量各有差异，药效差异可能较大。由于中药复方组成复杂，药效作用物质基础通常不明确[4－5]。目前，常见工艺参数优化方法多以复方干膏得率或复方中单个或多个化学成分的含量为评价指标[6－8]，但总量及个别化学成分不能代表复杂的物质基础，故往往不能客观、全面地反映在工艺变换过程中复方功效的变化，有时化学成分含量与药效指标会显示出矛盾的结果[9]。与之相比，采用药效学指标评价具有结果直观的优点。本试验结果表明，干膏得率与药效学指标不相关，以干膏得率来评价工艺条件的优劣并不适用。

酸枣仁为临床治疗失眠证常用中药[10－12]。多项关于酸枣仁物质基础及活性的研究均证明，酸枣仁水煎液及极性较强部位可延长阈上剂量戊巴比妥钠所致睡眠时间，增加阈下剂量戊巴比妥钠所致小鼠入睡率，具有明显的镇静催眠作用[13－15]。本试验中以戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间为指标考察酸枣仁复方提取工艺，结合工业生产的可行性，设计了不同醇体积分数、溶剂用量及提取时间对提取工艺的参数进行优化，确定其最佳提取工艺为水提取。这与传统提取方式一致（以水为溶剂），对生产设备及车间的安全要求相对较低，具有安全、无毒、生产成本低优点，若后续通过树脂分离纯化活性部位，可直接提取液上样，不需回收溶剂，树脂使用寿命长。为更好地控制复方质量，不同提取工艺对复方有效成分含量及其比例的影响仍有待进一步研究。