新型冠状病毒灭活方式对高效液相色谱法监测万古霉素血药浓度的影响

2020-05-21张晓旭侯林中张倩影缴万里刘晓红

中国药业 2020年9期

张晓旭，侯林中，姜晖，张倩影，缴万里，刘晓红△

（1. 河北省唐山市工人医院药学部，河北唐山 063000； 2. 河北省唐山中心医院药学部，河北唐山 063000；3. 华北理工大学附属医院药学部，河北唐山 063000）

新型冠状病毒肺炎（COVID－19）疫情自2019年12月暴发以来迅速蔓延至全球，截至2020年3月24日，全球COVID－19 患者已逾37 万例[1]。新型冠状病毒（SARS－CoV－2）为β 属冠状病毒，颗粒呈圆形或椭圆形并有包膜，其与蝙蝠严重急性呼吸综合征（SARS）样冠状病毒（bat－SL－CoVZC45）同源性超过85%[2]；对紫外线和热敏感，56 ℃30 min、乙醚、75%乙醇、含氯消毒剂、过氧乙酸和氯仿等脂溶剂可有效灭活病毒[3]。

现有数据基本证实，SARS－CoV－2 可经呼吸道飞沫、消化道和接触传播，且有传染性，COVID－19 临床表现多样，病情反复多变[4]。COVID－19 目前以对症治疗为主，没有特效药[3]。COVID－19 重型患者一般较轻型患者合并更多基础疾病，同时可能合并细菌、真菌感染，用药方案复杂，应通过治疗药物监测（TDM）优化用药[5]。COVID－19 重症患者的治疗方案中，糖肽类抗菌药物万古霉素为常用药，相关指南建议需监测其血药浓度[6]。万古霉素血药浓度的监测方法有微生物法、酶放大免疫法（EMIT）、荧光偏振免疫法，以及更常用、专属性强、准确度高及成本低的高效液相色谱（HPLC）法[7]。

对于SARS－CoV－2 的灭活方式，TDM 标本可考虑采用56 ℃30 min 水浴加热样本，亦可考虑采用短波紫外线处理样本进一步保证病毒灭活效果[8]。前期研究显示，经水浴56 ℃加热30 min 处理后，不会影响免疫法监测万古霉素的血药浓度[8]，但湿热灭活及紫外灭活对HPLC 法监测万古霉素血药浓度的影响尚未见研究报道。本研究中考察了SARS－CoV－2 不同灭活方式对HPLC 法监测万古霉素血药浓度的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

1200 型高效液相色谱仪，包括G1329A 型自动进样器、G1311A 型四元泵、G1315D 型二极管阵列检测器和G1316A 型柱温箱（美国Agilent 公司）。万古霉素对照品（中国食品药品检定研究院，含量100%，批号130360－200301）；甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯，水为实验室自制超纯水。健康人血清（唐山市工人医院检验科提供）。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent TC － C18柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：0.2% 三乙胺缓冲液（磷酸调pH 至3.2）－甲醇（15 ∶85，V／ V）；流速：1.2 mL／min；检测波长：236 nm；柱温：40 ℃。外标法计算得万古霉素血药浓度。

1.2.2 样品采集与制备

血样：选取唐山市定点医院—— 唐山市传染病医院收治的COVID－19 患者2 例（患者1，男，64 岁；患者2，女，67 岁），静脉滴注万古霉素（12 h 1 g，8 h 0.7 g），直至其达稳态血药浓度（半衰期约6 h，至少4 个固定剂量）[9]。下次给药前30 min 内抽取患者静脉血3 ～5 mL，置红帽头普通采血管中，3 500 r ／ min 离心10 min，吸取血清300 μL（空白人血清270 μL ＋万古霉素质控液30 μL），加入沉淀剂10%高氯酸100 μL，涡旋振荡2 min，15 000 r／min 离心10 min，吸取上清液50 μL。

质控液：称取万古霉素对照品11.60 mg，精密称定，置10 mL 容量瓶中，超纯水溶解并定容至刻度，制成质量浓度为1.16 mg／mL 的万古霉素贮备液，再经稀释，得质量浓度分别为7.25 mg／L 和29.00 mg／L 的万古霉素质控液Q2 和Q1。

1.2.3 血药浓度监测

56 ℃水浴：患者给药前30 min 同时抽取血样，置2 个红帽头普通采血管内，分别于56 ℃水浴加热样本0 min 和30 min 后测定。

紫外照射：取质控液（Q2 和Q1）和血样（血样1 和血样2），分别紫外照射0，30，60 min 后测定。

2 结果

2.1 水浴后血药浓度

2份血样56 ℃水浴加热0 min 和30 min 后检测，万古霉素血药浓度均无明显变化。详见表1。

2.2 紫外照射后血药浓度

质控液和血样紫外照射0，30，60 min 后检测，万古霉素降解，且随照射时间的增长，降解率成倍增长。详见表2。

表1 血样56 ℃水浴加热后万古霉素血药浓度监测结果（mg／L）

表2 紫外照射后质控液及血样万古霉素监测结果

2.3 紫外照射后万古霉素HPLC 图

结果见图1。

3 讨论

对于用于TDM 的样本，应考虑在不影响检测的前提下灭活病毒。可对COVID－19 患者血样进行56 ℃水浴加热30 min 处理，或于短波紫外条件下静置30 min，以保证病毒灭活。

有研究表明，万古霉素的稳定性不高，常温放置即可观察到颜色逐渐变红，可能是其分子结构中存在酚基及二酚基，酚类的水溶液遇光易水合或氧化成醌而呈粉红色[10]。万古霉素监测血样处理前4 ℃保存1 周，能保持相对稳定，处理后8 h 内能保持相对稳定，但处理后48 h 则开始出现降解[11]。

本研究结果显示，经56 ℃水浴加热30 min 处理后，不影响万古霉素血药浓度监测结果。因此，可采用湿热法56 ℃水浴30 min 灭活病毒后，以HPLC 法监测COVID－19 患者的万古霉素血药浓度。

对于TDM 样本，也可在短波紫外条件下静置30 min，进一步保证病毒灭活。由于SARS－CoV－2 也可能通过气溶胶传播，故前处理操作尽可能在生物安全柜里完成，试验前后采用紫外线消毒30 ～60 min[9]。前期试验研究未提到万古霉素质控液[12]、万古霉素监测样品（血样、脑脊液和关节液）[13 －15]需遮光保存，更未考察紫外照射对万古霉素血药浓度监测的影响。但同时发现，万古霉素质控液虽未遮光，但保存于4 ℃冰箱、6 个月内未有明显降解。

本研究结果显示，紫外照射极大地加快了万古霉素的降解。可能是由于万古霉素质控液存放于透明离心管内，而血样存放多了采血管帽头与标签的遮挡，故降解率不同。但即使有遮挡，血样暴露于紫外条件下，万古霉素的降解仍对监测结果有较大影响，故采用HPLC 法监测COVID－19 患者万古霉素血药浓度时，不可用短波紫外灭活样本病毒。同时，万古霉素血样、质控液在接受标本时（传递窗等地方）及生物安全柜内处理过程中常可能暴露于紫外线下，故应注意万古霉素质控液与血样均要避免紫外照射。