重组溶瘤2型单纯疱疹病毒荧光定量PCR检测方法的建立与验证*

王磊兰，陈 莹，吴基良*，刘滨磊

(1.湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437100；2.武汉滨会生物科技股份有限公司)

癌症发病率逐年增长，严重危害到全世界人民的健康，寻找能够彻底根除肿瘤的方式迫在眉睫。溶瘤免疫治疗作为一个新兴的生物治疗热点方向，可以激发和利用人体免疫系统去杀伤肿瘤[1]，它的原理是改造天然病毒的基因从而制成特殊的溶瘤病毒，靶细胞中抑癌基因的失活或缺陷使得溶瘤病毒能够有选择性地感染肿瘤细胞，并且在其内大量复制，最终摧毁具有无限增殖能力的肿瘤细胞[2-3]。

oHSV2的基本原理是敲掉野生型II型单纯疱疹病毒ICP34.5和ICP47基因并插入人源的GM-CSF基因，从而降低病毒的神经毒性以及增强机体对病毒的免疫力[4]。它是生物公司研发的肿瘤生物治疗制品，目前处于Ⅰ期临床试验，急需建立一种方便、灵敏度较高和特异性较好的方法，来检测临床癌症患者经oHSV2治疗后，其体液(血液)中的oHSV2，从而了解oHSV2在体内的复制情况，为后续的临床试验提供技术支持。本研究根据oHSV2的基因序列设计了一对特异性引物，提取了前期已经重组好的阳性质粒pHG52d34.5CMVhGM-CSF，测定浓度并换算后梯度稀释为荧光定量PCR的模板，经过反应条件及反应体系的优化后，建立了一种快速检测oHSV2的荧光定量PCR方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌液及模拟临床样本

pHG52d34.5CMVhGM-CSF菌液由武汉滨会生物科技股份有限公司实验室重组、转化、鉴定和保存，模拟临床样本(血液)由实验室志愿者捐献。

1.1.2 主要试剂和仪器

TIANpure Mini Plasmid kit Ⅱ(TIANGEN，#R6508)；SYBR Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO，QPK-201)；QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen，51104)；RNase-Free water(biosharp，680579)；定量PCR仪(ABI，Step one Plus)；高速冷冻离心机(大龙，D3024R)。

超微量分光光度计(Thermo Scientific，NanoDrop One)。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成

参照oHSV2的GM-CSF基因序列登录Beacon Designer8.0软件设计特异性引物：上游引物：5′-TCCTGAACCTGAGTAGAGA-3′；下游引物：5′-CTGGAGGTCAAACATTTCTG-3′，由擎科生物(武汉)有限公司合成。

1.2.2 质粒标准品的制备

TIANpure Mini Plasmid kit Ⅱ试剂盒提取质粒后，通过超微量分光光度计Nanodrop 测出该质粒的浓度，可根据拷贝数计算公式算出拷贝数，质粒分装后于-80℃冰箱保存，避免反复冻融后DNA降解。

1.2.3 PCR方法的建立

(1)SYBR Green荧光定量PCR反应体系的建立及优化

参考相关试剂说明书，配成10μL的反应体系，标准品1μL ，SYBR Green Mix 5μL，10μmol浓度的引物(0.25μL 、0.4μL、0.5μL)，DEPC水补充所需的反应体积。反应条件为：95℃ 20s预变性，(95℃ 1s，退火温度20s) × 38个循环，60℃ 5s，95℃ 1s，退火温度考虑50℃、53℃、56℃、60℃、63℃5个数值，熔解曲线参数是Step one Plus PCR仪自带的程序。

(2)实时定量PCR标准曲线的建立

用RNase-free water将分装后冻存的质粒稀释至108、107、106、105、104、103copies/μL不同浓度作为阳性模板进行PCR扩增，待反应结束后，由step one plus电脑分析软件生成标准曲线、扩增曲线以及熔解曲线等。

(3)特异性试验

运用上述建立好的方法，对DNAzol法提取的各种模板DNA进行扩增(包括野生型Ⅰ型、Ⅱ型单纯疱疹病毒、BGC823细胞、LOVO细胞及A375细胞的DNA)，观察是否出现交叉反应。

(4)敏感性试验

对模板质粒进行定量PCR扩增，根据Ct值和线性关系系数等确定最适宜检测限。

(5)重复性试验

准备108、107、106、105、104、103copies/μL共6个浓度梯度的质粒液，用本方法重复扩增3次，每一个浓度设置3个复孔，评估组内、组间变异系数。

(6)荧光定量PCR检测方法的验证

EDTA采血管采集捐献者的血液，取血浆分别与103、104、105.5、106.5copies/μL质粒DNA混合后用QIAamp DNA Mini kit试剂盒提取总DNA，依次标记为样本103、104、105.5、106.5，并进行SYBR Green real-time PCR反应，根据标准曲线计算出样本的拷贝数，依据中国药典的方法学验证指导原则，若分别在103、104、105.5、106.5的±20%，认为该方法验证通过。

2 结果与分析

2.1 SYBR Green real-time PCR最佳反应条件与反应体系

经过多次实验调整后，最佳退火温度为60℃，最佳引物量为0.5μL，擎科生物有限公司推荐引物浓度为10μmol。

2.2 SYBR Green real-time PCR的建立

随着pHG52d34.5CMVhGM-CSF模板拷贝数的的降低，对应的Ct值逐渐增加，109、108、107、106、105、104、103、102copies/μL质粒对应的三个副孔Ct值平均值分别为：9.782、13.360 、17.014、20.935、24.697、28.139、31.100、31.831。质粒各稀释度的溶解曲线显示单一峰，表明没有引物二聚体和非特异性产物，质粒稀释到102copies/μL时的扩增曲线及Ct值与103copies/μL相近，说明本实验的检测下限是103copies/μL。标准曲线一般为6个点，因此检测上限定为108copies/μL，见图1(封三)。

2.3 SYBR Green real-time PCR的标准曲线

稀释后不同浓度的质粒，作为标准品进行PCR扩增并生成扩增曲线和标准曲线，相关回归方程为y=-3.283log(x)+40.328，R2=0.996， E=101.651﹪，线性范围为103copies/μL～108copies/μL。见图2(封三)。

2.4 荧光定量PCR方法的特异性结果

检测野生型Ⅰ型和Ⅱ型单纯疱疹病毒，BGC823细胞、LOVO细胞、A375细胞提取的DNA，结果均为阴性。见图3(封三)。

2.5 荧光定量PCR方法的重复性评估

对多次实验结果分析后发现，组内变异系数为0.357%～1.156%，组间变异系数为1.06% ～3.35% 。见表1。

表1 SYBR Green荧光定量PCR的批内和批间重复性试验结果

2.6 验证结果

运用该方法检测模拟临床样本，此次实验108、107、106、105、104、103copies/μL质粒标准品的CT值平均值分别为：13.973、18.166、21.562、24.993、28.269、30.633，计算出标准曲线方程为：y=-3.344log(x)+41.325，而4个模拟样本的结果见表2，显示检测限内的阳性模拟样本可以被检测出来，并且拷贝数能够达到验证要求。

表2 模拟临床样本检测结果

3 讨 论

近年来，由于SYBR Green real-time 荧光定量PCR操作比较简单、 可快速获得实验结果、受实验条件影响小、适用范围广等优点而受到越来越多方法学研究者的青睐，为各种病毒、细菌、真菌等病原体定量检测的首选方法之一[5]。然而，TaqMan探针法在稳定性、特异性、相关系数等方面与染料法无明显的差别[6]，且价格昂贵、易受环境污染、设计困难。综合各方面因素考虑，本研究采用SYBR Green 染料法。SYBR Green Ⅰ是一类具有绿色激发波长的荧光染料，能够与dsDNA的双螺旋小沟区域结合，并且结合后荧光迅速增强，而处于游离状态的时候，荧光信号则减弱。因此，双链DNA的数量可以用SYBR Green荧光信号强度来表示[7]。

令人振奋的是，oHSV2在一些人源和鼠源肿瘤细胞系中体现出了一定的杀瘤效果[8]，为oHSV2后续的临床试验提供了依据。而本研究首次建立了oHSV2的real-time PCR方法，显示了较好的特异性、敏感性以及稳定性，能够检测出血液内的oHSV2，为临床样本的快速检测提供了方法学支持。