洛利普兰对棕榈酸作用下SH-SY5Y细胞损伤的保护作用研究*

刘 冉，花亮亮，陈 娟，蔡 飞，李彩蓉**

(1.湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437100；2.糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室)

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是老年人最常见的神经退行性疾病，其临床特点主要表现为进行性的认知功能障碍[1]。AD的病因是多因素的，一般认为遗传、环境和饮食因素之间的相互作用在AD的发病机制中起着一定的作用。大量的流行病学研究表明，富含饱和脂肪的饮食会增加患AD的风险[2]；大量实验室研究也发现饱和脂肪酸饮食可增加血浆中饱和游离脂肪酸、棕榈酸和硬脂酸的水平，导致啮齿动物模型出现认知障碍以及学习和记忆缺陷。

SH-SY5Y细胞衍生于人的神经母细胞瘤细胞系，具有神经元的某些特性，可用于神经系统疾病的发病机制研究。棕榈酸(palmitic acid，PA)可造成脂毒性损伤，是用来制作各种损伤模型的常见饱和脂肪酸之一。本实验以SH-SY5Y细胞为研究对象，采用PA作为致病因子，研究磷酸二酯酶抑制剂洛利普兰(rolipram，Rol)对PA作用下SH-SY5Y细胞的影响，并探究相关机制，为研究AD的发病机制和药物防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞与相关试剂

SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞系(武汉华联科技生物有限公司)；DMEM培养基(Hyclone公司)；胎牛血清 (FBS，Gibco公司)；青/链霉素(P/S，Hyclone公司)；0.25% EDTA 胰酶(Gibco公司)；Rol(Solarbio公司)；棕榈酸(Solarbio公司)；Anti- Cleaved-Caspase3(Cell Signaling Technology)；Anti-GAPDH(Cell Signaling Technology)；MTT(大连美仑生物科技有限公司)；超氧化物阴离子荧光探针(DHE，碧云天公司)；DAPI(武汉科瑞有限公司)；其它为国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

用含有10%胎牛血清和1%青/链霉素的DMEM培养基培养细胞，水平放置在37℃、5%CO2的细胞培养箱，待细胞生长至融合度80%～90%时，用0.25% EDTA 胰酶进行消化传代培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 实验分组

给予0.2、2、20、100、200μmol/L的Rol作用细胞，培养24h，进行细胞存活率的检测；给予不同浓度Rol(2.5、5、10、20μmol/L)进行预处理1h，然后给予 PA(150μmol/L)作用24h，检测不同浓度Rol对PA作用下SH-SY5Y细胞存活率的影响；选取浓度10 μmol/L Rol观察其对150μmol/L PA作用下SH-SY5Y细胞内ROS以及凋亡蛋白Cleaved-caspase-3表达的影响。

1.3 MTT检测细胞存活率

取出生长至融合度为80%～90%的细胞，将其传代消化，并种于96孔板中，每孔中细胞数量约为8×103。种板结束后于培养箱中培养24 h，待孔板中细胞生长至融合度为70%～80%时，吸出原有培养基并加入不同浓度的Rol和PA作用于细胞。作用24 h后，避光操作，每孔加入预先配置好的MTT溶液20μL ，作用4h，避光操作。小心吸出孔内液体，每孔加入150μL DMSO，490nm吸光度检测每孔OD值，计算细胞存活率。

1.4 DHE染色检测细胞内ROS

在超净台中，将细胞爬片加入到24孔板中，待培养瓶中细胞长到80%～90%，开始种板，细胞数目约为5×104，注意种板时不要剧烈晃动。24 h后，孔板中细胞长到70%～80%后开始给药，分别给药24h后，PBS清洗3遍，洗去死细胞。避光配置DHE试剂溶液，每孔加250μL(覆盖孔板即可)，培养箱放置30min。在培养箱取出，PBS清洗3遍，将配置好的DAPI试剂溶液均匀的滴加在爬片上15μL左右，作用10min。在培养箱取出，PBS清洗3遍， 取出爬片，放置在已经加好抗荧光萃取剂的载玻片上。将玻片放入荧光显微镜下观察荧光强度及照相。

1.5 Western blot检测凋亡蛋白Cleaved-caspase3的表达

各组取30μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，用60V电泳30min后转120V电泳1h左右；在300 mA下转印160min后将膜放在5%脱脂奶粉中室温封闭1.5h；加入适当用TBST按比例(1∶1000)稀释的Antibody Cleaved-caspase3，并 4℃孵育过夜。一抗孵育过后，用TBST 洗涤3次后加入适当用TBST按比例(1∶5000)稀释的二抗，孵育1h。二抗孵育过后，用TBST 洗涤3次后避光显影。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 不同浓度Rol对SH-SY5Y细胞存活率的影响

给予0.2、2、20、100、200μmol/L 的Rol作用SH-SY5Y细胞24h，采用MTT检测细胞存活率。结果发现0.2μmol/L和2μmol/L 的Rol对细胞存活率没有明显影响，20μmol/L、100μmol/L及200μmol/L 的Rol可降低细胞存活率(P<0.05)，见图1。

与Con组比较，**P<0.05

2.2 不同浓度Rol对PA作用下SH-SY5Y细胞存活率的影响

给予不同浓度Rol(2.5、5、10、20μmol/L)进行预处理1h，然后给予 PA(150μmol/L)作用24h，采用MTT检测细胞存活率。结果发现2.5μmol/L和5μmol/L 的Rol稍微增加PA作用下细胞存活率，但与PA组相比没有统计学差异；10μmol/L与20μmol/L的Rol可增加PA作用下细胞存活率，与PA组相比有显著性差异(P均<0.05)，结合前面不同浓度Rol对细胞存活率的影响，我们选择10μmol/L的Rol进行后面的实验，见图2。

与Con组比较，**P<0.01；与PA组比较，##P<0.01

2.3 Rol对PA作用下SH-SY5Y细胞内ROS的影响

将圆形载玻片置于6孔板中，然后种入SH-SY5Y细胞进行培养。实验分为正常(Con)组、PA组、PA+Rol组、Rol组。预先给予Rol，然后给予PA作用24h。实验结束后给予荧光染色，观察各组细胞内ROS的表达。结果发现PA处理后，细胞内的ROS荧光染色明显增加，表现为粉红色点状变多；预先给予Rol预处理，可以减轻PA所导致的细胞内ROS表达，与PA组相比，有显著性差异(P<0.01)；Rol组对细胞内ROS无明显影响。见图3(封二)。

2.4 Rol对PA作用下SH-SY5Y细胞凋亡蛋白Cleaved-Caspase3的影响

将SH-SY5Y细胞在6孔板中进行培养，实验分为正常(Con)组、PA组、PA+Rol组、Rol组。预先给予Rol，然后给予PA作用24h。实验结束后提取总蛋白，用Western blot检测凋亡蛋白Cleaved-Caspase3的表达。结果发现PA可导致Cleaved-Caspase3蛋白表达升高，与Con相比有明显差异(P<0.01)；预先给予Rol预处理，可以减轻PA所导致的凋亡蛋白表达，与PA组相比，有显著性差异(P<0.01)；Rol组对Cleaved-Caspase3蛋白无明显影响。见图4(封二)。

3 讨 论

随着社会人口的老龄化，AD的发病率越来越高，饱和脂肪和富含棕榈酸盐的饮食会诱发AD和轻度认知障碍。AD的病理特征包括细胞内聚集的超磷酸化tau蛋白形成神经纤维缠结，细胞外聚集的淀粉样蛋白形成老年斑，而BACE1 是淀粉样蛋白形成的核心因素。大量的实验研究表明，在许多AD啮齿动物模型中，高脂肪饮食可增加BACE1活性和促进淀粉样蛋白形成[3]。因此，利用PA制作脂毒性损伤模型可为体外研究AD的发病提供实验模型。大量的研究表明，氧化应激及细胞凋亡在AD的发病机制中起着重要作用，进一步研究其发病机制和药物防治是目前研究的热点问题。

磷酸二酯酶抑制剂通过抑制磷酸二酯酶活性，增加细胞内cAMP的浓度，增加钙离子内流，产生正性肌力的作用，在心衰、哮喘及勃起功能障碍等疾病中使用较为广泛[4]。Rol是一种磷酸二酯酶4的抑制剂[5]，其对AD认知功能障碍的作用及作用机制尚未见报道。本研究以人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y为研究对象，采用PA制作脂毒性损伤模型，观察Rol的防治作用。结果发现0.1～10 μmol/L Rol对细胞存活率无明显影响，20～200μmol/L的Rol对细胞的损伤逐渐增大；MTT检测显示10μmol/L的Rol可增加150μmol/L PA作用下SH-SY5Y细胞存活率；研究发现PA可致SH-SY5Y细胞内ROS增加，导致Cleaved-caspase3蛋白表达上调，预先给予Rol可逆转上述改变。以上结果提示Rol对PA所致细胞脂毒性损伤具有保护作用，其保护机制可能与抑制细胞内氧化应激及细胞凋亡有关，该研究可为Rol用于AD的防治提供实验和理论依据。