温肾醒脑方对血管性痴呆大鼠脑组织Nrf2-ARE信号通路的影响

胡久略，商 健，侯紫君，臧文华，卞 华，王 军，

王三沆1,2，樊 赟1,2，张瓅方1,2

(1.河南省张仲景方药与免疫调节重点实验室，南阳 473004；2.南阳理工学院张仲景国医国药学院，南阳 473004；3.河南中医药大学基础医学院，郑州 450046)

血管性痴呆(vascular dementia，VD)是由于脑血管系统的病理改变导致的缺血性、缺氧缺血或者出血性脑损伤所引起的严重认知功能障碍综合征。VD是继阿尔茨海默氏病之后世界上第二常见的老年痴呆症，约占所有痴呆疾病的15%～20%[1]。认知功能障碍被广泛认为是痴呆患者表现的典型特征[2]，包括认知功能和运动功能缺失，功能域和记忆障碍。目前临床直接用于VD治疗的药物较少，且相关的药效学研究不系统。温肾醒脑方在临床上广泛用于治疗VD，实验观察温肾醒脑方对双侧颈动脉结扎诱导的大鼠VD的改善作用及其抗氧化应激作用机制。

1 实验材料和仪器

1.1 实验药物制备

(1)实验药物：温肾醒脑方中附子、巴戟、桂枝、半夏、石菖蒲、赤芍、淫羊藿、生晒参、大黄、远志、甘草均一次性购于河南省药材公司，并经南阳理工学院中药教研室鉴定。

(2)制备：全方(附子20 g、巴戟15 g、桂枝12 g、半夏10 g、石菖蒲12 g、赤芍15 g、淫羊藿10 g、生晒参10 g、大黄6 g、远志10 g、甘草6 g。加水回流提取两次,第一次加10倍水提取2 h,第二次加8倍水提取1.5 h,药液过滤、合并浓缩至含生药1 g/mL,4 ℃保存备用,用时稀释适当浓度。

1.2 药物和试剂

温肾醒脑方药材购于张仲景大药房，经南阳理工学院中药教研室鉴定为道地药材。脑复康片：0.4 g/片(批准文号：国药准字H13021787)，购自石药集团欧意药业有限公司。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)、一氧化氮合成酶(NOS)试剂盒，均购买自南京建成生物工程研究所。H &E染色试剂盒，购自北京雷根生物科技有限公司。Trizol Reagent购自invitrogen公司；逆转录试剂盒、扩增试剂盒、引物设计及RT-PCR试剂耗材，均购自Takara公司。组织蛋白裂解液，蛋白酶抑制剂和LightShift Chemiluminescent EMSA试剂盒均购自ThermFisher Scientific公司。核因子NF-E2相关因子(Nrf2)、Kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)、醌NADH脱氢酶(NQO1)、血红素氧合酶1(HO-1)、GAPDH抗体均购自Abcam公司。山羊抗兔的二抗、BCA蛋白定量试剂盒和SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。细胞核蛋白与细胞质蛋白抽提试剂盒，购于碧云天生物有限公司。ECL发光液购自Merck Millipore公司，0.45 μm PVDF膜购自美国伯乐公司。牛血清白蛋白(BSA)购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 实验动物

健康成年Wistar大鼠70只，雄性，清洁级，体重200～250 g，由河南省实验动物中心提供。动物许可证号：医动字第20-012号。

1.4 主要仪器

Morris水迷宫及实验视频分析系统，上海吉量软件科技有限公司；多功能酶标仪，瑞典Tecan公司；StepOnePlus荧光实时定量PCR仪，美国Applied Biosystems公司；蛋白电泳凝胶仪，美国Biotech生物有限公司；凝胶成像系统，Bio-Rad公司；Leica TP1020生物组织自动脱水机、Leica EG1140石蜡包埋机、Leica RM2235全自动轮转石蜡切片机，均是德国莱卡公司；高速低温离心机，日本Hitachi公司。

2 实验方法

2.1 分组、模型建立和给药

根据“劳倦过度、房室不节”[3]和高脂饮食制作肾虚痰瘀模型[4-5]：每天在水深25 cm，水温25 ℃，容积5 L的圆型玻璃缸内强迫大鼠游泳至无力而下沉时捞出以诱导劳倦过度；每只雄鼠与6只动情期雌鼠同笼，每天更换动情期雌鼠以诱导房室不节，共30 d。同时喂饲高脂饲料(高脂饲料组成：81.3%普通饲料、0.5%胆酸钠、3%胆固醇、0.2%丙基巯氧嘧啶、10%猪油、5%白糖)20 g，火腿肠14 g，连用30 d。肾虚痰瘀模型建立成功后，用10%水合氯醛麻醉大鼠后，仰卧固定在手术台上，消毒后，颈正中切口，纵向切开皮肤及皮下组织，钝性分离双侧颈总动脉，手术中注意避免刺激迷走神经。随后用无菌手术线结扎双侧颈总动脉，观察大鼠生命体征正常，再缝合伤口，放回笼饲养。其中假手术组仅分离颈总动脉后不结扎缝合伤口，放回笼饲养。大鼠造模清醒后给与自由饮水。

肾虚痰瘀VD模型建立成功按照随机分组，每组10只：正常组、假手术组、模型组、脑复康组(0.15 g/kg)、温肾醒脑方给药组(高剂量组5 g/kg、中剂量组2.5 g/kg、低剂量组1.25 g/kg)。其中正常组、假手术组、模型组给予蒸馏水灌胃2 mL/d，灌胃给药4周。

2.2 行为学实验

灌胃给药结束后，采用Morris水迷宫检测大鼠的学习记忆功能。检测指标包括定位航行实验：记录大鼠下水至站到隐藏平台的时间(逃避潜伏期)，如果2 min还未找平台，实验者将其引导至平台上停留15 s，逃避潜伏期记为2 min，连续进行5 d实验；定位航行能力实验检测结束后，次日进行空间探索实验，检测大鼠2 min内在隐藏平台所在象限的游泳总距离和跨越平台的次数。

2.3 样本收集

在空间探索实验结束后，将大鼠麻醉后，腹主动脉取血，室温放置2 h后，3 000 r/min离心10 min，取处上清液保存-80 ℃；用生理盐水灌注心脏后直至肝脏颜色变成白色后，用剪刀快速断头，迅速剥离完整脑组织。部分放入10%中性甲醛，部分迅速放入液氮过夜，第2 d放入-80 ℃冰箱保存。

2.4 脑组织生化指标检测

按照试剂盒说明书对SOD、MDA、GSH-Px、NOS指标进行检测，运用多功能酶标仪进行检测。

2.5 病理切片观察

脑组织用10%中性甲醛溶液浸泡固定48 h，脱水，石蜡包埋，连续切片(5 μm)，H &E染色后，中性树脂封片。在光镜下观察组织病理变化并拍照。

2.6 RT-PCR检测mRNA

根据GenBank提供序列号设计与合成特异性引物:NQO1(NM_012580.2)、HO-1(NM_01258.2)、GAPDH(NM_017008.4)序列如表1所示。各组大鼠脑组织100 mg加入Trizol试剂，按照说明书进行总mRNA提取分离纯化。按照PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)逆转录试剂盒说明书进行反转录。RT-PCR反应体系：2×TB Green premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 7 μL，总体积20 μL。反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。扩增结束后分析扩增曲线和溶解曲线，溶解曲线程序：95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，记录各组样本扩增反应的Ct值，运用公式2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。

表1 大鼠引物相关信息Table 1 Primer related information of rats

2.7 Western Blot检测

取各组大鼠脑组织100 mg加入蛋白裂解液进行匀浆，4 ℃下12 000 r/min离心10 min。取上清液，取10 μL稀释用于BCA法蛋白定量。剩余的加入Loading buffer进行蛋白变性。取50 μg蛋白样本上样进行电泳分离，然后加入滤纸、PVDF膜和海绵，300 mA转膜1 h。转膜完后加入BSA封闭液，摇床上室温封闭2 h。按照一抗说明书稀释一抗，加入一抗，摇床上4 ℃孵育过夜。回收一抗后，加洗涤液3次，每次10 min。按照二抗说明书稀释二抗，加入二抗，摇床上室温封闭1 h。回收二抗后，加入3次，每次10 min。使用ECL发光液试剂进行蛋白检测。

2.8 凝胶电泳迁移(EMSA)实验

取100 mg脑组织采用细胞核蛋白与细胞质蛋白抽提试剂盒提取核蛋白，取适量用于BCA法蛋白定量。对寡核苷酸单链进行生物素标记，经纯化、变性、退火等操作后可获取的双链生物素标记探针。按照EMSA试剂盒说明书进行实验，凝胶电泳迁移结合反应体系中10 μg核蛋白中含10×Binding buffer 2μL、poly(dI·dC) 1 μL、NP-40(1%)1 μL、EDTA(200 mmol/L) 0.2 μL、MgCl2(100 mmol/L) 1 μL，Glycerol(50%) 1 μL,生物素标记的双链探针 20 fmol，超纯水补足至20 μL。6%PAGE胶中进行电泳分离后，凝胶中的样本湿法电转至尼龙膜上，转移后将膜在120 mJ/cm2紫外交联60 s。封闭，抗体孵育，洗涤，加底物平衡，洗涤。加入ECL后在成像仪上显影。

2.9 统计学处理

3 结果

3.1 温肾醒脑方对认知能力改善情况

如表2所示，定位航行实验中前2 d各组大鼠潜伏期没有明显差异。第3 d开始，VD模型组较正常组潜伏时间更长。第4 d与VD模型组比较，脑复康组和温肾醒脑方高剂量组潜伏时间较短有显著差异，有统计学意义。第5 d各给药组与VD组潜伏时间都有显著差异(P<0.01)。如表3所示，空间搜索实验中，与正常组比较，VD模型组游泳的总距离和穿越平台次数较少，有统计学意义；与VD模型组比较，温肾醒脑方高剂量组和脑复康组穿越平台次数和游泳的总距离都有显著差异(P<0.01)。

表2 各组定位航行实验潜伏时间比较Table 2 Comparison of latency time of positioning navigation experiments in each group

注：*P<0.05、**P<0.01，vs正常组；#P<0.05，##P<0.01，vs模型组。

表3 各组空间搜索实验目标象限游泳总距离及穿过站台总数比较Table 3 Comparisons of total swimming distance and total number of crossing platform in each group of space search experiment target quadrant

注：*P<0.05，**P<0.01，vs正常组；#P<0.05，##P<0.01，vs模型组。

3.2 温肾醒脑方对脑组织生化指标的影响

如图1所示，与正常组比较，VD模型组大鼠脑组织中SOD、GSH-Px和NOS的含量明显降低，同时MDA的含量显著增加；与VD模型组，脑复康组和温肾醒脑方各给药组的SOD、GSH-Px和NOS的含量有一定程度的升高，同时MDA的含量显著降低，且有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。

3.3 温肾醒脑方对脑组织中NQO1和HO-1 mRNA表达影响

如图2所示，与正常组比较，VD模型组大鼠脑组织NQO1和HO-1mRNA的表达量显著减少(P<0.01)；与VD模型组比较，脑复康组和温肾醒脑方各给药组的NQO1和HO-1mRNA的表达量有不同程度上的升高，且均有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。

3.4 温肾醒脑方对脑组织Nrf2、Keap1、NQO1、HO-1蛋白表达的影响

如图3所示，与正常组比较，VD模型组大鼠脑组织细胞核中Nrf2的蛋白表达量显著降低；与VD模型组比较，脑复康组和温肾醒脑方各给药组的明显升高。然而，大鼠脑组织细胞质中Keap1的蛋白表达量相反，与正常组比较，VD模型组大鼠脑组织细胞质中Keap1的蛋白表达量较高；与VD模型组比较，脑复康组和温肾醒脑方各给药组的明显降低。同时，脑复康组和温肾醒脑方高剂量组大鼠脑组织中NQO1和HO-1的蛋白表达量较高，与VD模型组比较。

*P<0.05，**P<0.01，vs 正常组；#P<0.05，##P<0.01，vs模型组图2 温肾醒脑方对脑组织中NQO1和HO-1 mRNA表达影响Fig.2 Effect of Wenshen Xingnao decoction on the expression of NQO 1 and HO-1 mRNA in brain tissue

+、-分别表示组织蛋白表达(活性)的高和低；sham为假手术图3 温肾醒脑方对脑组织Nrf2、Keap1、NQO1、HO-1蛋白表达的影响Fig.3 Effect of Wenshen Xingnao decoction on the protein expression of Nrf2,Keap1,NQO1 and HO-1 in brain tissue

3.5 温肾醒脑方对脑细胞核中Nrf2-ARE结合活性的影响

如图4所示，在正常组和假手术组脑组织中，Nrf2-ARE的结合活性存在，然而模型组中这种结合活性不明显了。在给予温肾醒脑方药和脑复康后，结合活性增加，特别是脑复康和温肾醒脑方高剂量给药组最为显著。

图4 温肾醒脑方对脑细胞核中Nrf2-ARE结合活性的影响Fig.4 Effect of Wenshen Xingnao decoction on Nrf2-ARE binding activity in brain nucleus

4 讨论

VD作为一种的由于脑血管疾病导致脑组织损伤，认知功能障碍为主病理特征的临床综合征，至少20%的痴呆是由它引起的，仅次于阿尔茨海默病[6]。表现为视空间功能障碍、记忆力和学习能力下降，运动障碍等等[7]。双侧颈总血管结扎后大鼠的定位航行能力和空间搜索能力下降明显符合VD症状，但是温肾醒脑方干预后能够改善提高这些能力，一定程度上改善了VD的认知障碍。

目前VD的发病机制研究主要与氧自由基、胆碱能系统、氨基酸神经递质、神经细胞凋亡等相关。其中氧自由基产生是心脑系统缺血性致脑损伤的核心环节之一[8-9]。动物脑缺血会使得脑组织产生大量的自由基和过氧化产物，如MDA、过氧化脂质(LPO)，同时清除自由基和过氧化物的相关酶SOD和GSH-Px明显降低。然而，给予脑复康和温肾醒脑方后，脑组织抗氧化指标和脑组织病理情况的改善说明，温肾醒脑方一定程度上能够提高大鼠机体清除脑组织自由基的能力，改善脑组织损伤。

Nrf2是内源性抗氧化防御系统的主要调节因子，具有维持体内氧化和抗氧化平衡，抑制炎症和细胞凋亡等作用[10]。Nrf2基因敲除小鼠对应激源的敏感性降低，氧化应激损伤明显增加[11]。生理状态下，Nrf2与Keap1耦联稳定存在于细胞质中。Nrf2-Keap1信号通路是机体抗氧化的重要途径之一，外来刺激引起Nrf2与Keap1发生解离，Nrf2进入细胞核内，与ARE的特异识别位点相互结合，启动ARE增加下游抗氧化酶如(NQO1、HO-1)的表达和GSH的合成，增加细胞对氧化应激刺激的抗性。对Nrf2-ARE信号的激活且可以反向抑制Nrf2蛋白的降解，增加Nrf2蛋白的转录活性，进一步保护下游基因的表达[12]。然而，双侧结扎颈总动脉VD大鼠，Nrf2的表达较少，降低了下游NQO1和HO-1的表达，使得脑组织损伤的产生。温肾醒脑方可能通过增加Nrf2进入细胞核内转录活性，启动ARE调控的NQO1、HO-1的表达。NQO1表达量的增多，可以维持内源抗氧化物的还原性；HO-1表达量增加能够产生更多血红素，而血红素有很强的抗氧化性。在这些酶的作用下，氧化应激被抑制，多余的ROS得到清除，最终实现体内氧化还原平衡，达到改善VD认知障碍的作用。

5 结论

根据内经“阳化气，阴成形”的理论，认为VD发生的病机多为肾(阳)虚痰瘀而致，基于此，创制了温肾醒脑方。温肾醒脑方由经典名方四逆汤和地黄饮子化裁而来，具有温肾助阳、祛瘀化痰、醒脑开窍之功。研究表明，温肾醒脑方能够通过Nrf2-ARE信号通路，升高SOD和GSH-Px，降低MDA、LPO，清除过多氧自由基，维持体内氧化还原平衡，改善双侧结扎颈总动脉VD大鼠的认知障碍。为“阳化气，阴成形”理论在VD中的运用提供了科学依据。