黄芪多糖对梗阻性黄疸大鼠肠损害的治疗作用及其机制探讨

黄忠义，陈飞，张贯启，邬善敏

武汉大学人民医院，武汉 430000

梗阻性黄疸(OJ)在充分的术前评估和术后护理仍具有较高的病死率，其主要原因为肠黏膜屏障破坏、肠源性毒血症形成，最终导致多器官功能不全[1,2]。基础和临床研究[1]已证明，OJ可导致肠内细菌移位和内毒素血症，这是导致全身炎症反应及严重并发症的关键因素，其中小肠黏膜屏障功能损害是最关键的环节。所以，减轻OJ患者肠损害对预后至关重要。全身炎症反应又可加重OJ的病情，炎症因子包括促炎因子和抗炎因子，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8作为促炎因子可促进炎症的发展，相反抗炎因子IL-1Ra、IL-4、IL-6、IL-10、IL-11、IL-13可通过调节促炎因子的反应来阻止这一过程，这是生物组织对炎性过程的保护反应[3]。APS是从黄芪根中提取的多糖，具有免疫调节、抗炎、抗氧化、抗肿瘤和抗病毒活性等功能[4～9]。虽然有许多研究表明APS具有抗炎作用，但是对OJ肠功能是否有保护作用仍然不清楚。2019年4～9月，我们观察了APS对OJ大鼠肠损害的治疗作用，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 药物及主要试剂 APS生理盐水溶液(40 mg/mL，Sigma公司)。TLR4、NF-κB P65、PCNA一抗购自南京建成公司，TNF-α、IL-1β、IL-Ra、IL-10的ELISA试剂盒购自安迪生物，DAO检测试剂盒和I-FABP检测试剂盒购自武汉谷歌生物有限公司。

1.2 实验动物及分组 雄性Wistar大鼠48只，10～12周龄，均购自北京维通利华实验动物有限公司。所有大鼠均在武汉大学人民医院动物中心饲养，环境温度控制在25 ℃，模拟12 h白天/12 h夜晚的昼夜循环，自由进食水。所有大鼠随机分为干预组、模型组、对照组各16例。

1.3 OJ模型制备、APS应用及标本取材 手术操作均在异氟烷吸入麻醉下进行。腹部正中行长约2 cm左右的纵切口切开皮肤，再用止血钳向上轻提腹壁，剪刀剪开腹壁进入腹腔。充分止血后将胃向上翻起露出十二指肠及胆总管，再用眼科镊钝性分离胆总管至左右胆管汇合处。模型组及干预组在靠近左右胆管汇合处双重结扎并离断，对照组仅分离胆总管。术后每天灌胃时观察大鼠毛发及巩膜黄染情况来评估造模情况。模型组有1只在术后9天死亡，解剖发现为胆漏造成腹腔感染而死，其余老鼠正常，该老鼠直接剔除未进行增补。在造模24 h之后，干预组大鼠灌胃给予APS生理盐水溶液(100 mg/kg)，对照组及模型组灌胃给予同量生理盐水，2次/d，分别为08∶00和20∶00两个时间点。各组大鼠在实验14天时取血，血液均取自下腔静脉,静止30 min后于4 ℃低温下离心，以12 000 r/min速度离心10 min，取血清，并冻于-80 ℃深低温冰箱备用。取血后处死，取肝脏左外叶肝组织和上段小肠组织，部分用4%中性多聚甲醛固定24 h，制备石蜡切片，待光镜观察。另一部分放入冻存管，于-80 ℃深低温冰箱冰冻保存，用于后续实验指标检测。

1.4 大鼠血清DOA、I-FABP及组织增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白检测

1.4.1 血清DOA、I-FABP 采用ELISA法。具体操作步骤：①抗鼠二胺氧化酶单抗包被于酶标板上，标本和标准品中的二胺氧化酶会与单抗结合，游离的成份被洗去。②加入酶标抗体，抗鼠二胺氧化酶抗体与结合在单抗上的鼠二胺氧化酶结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。③加入显色底物，若反应孔中有二胺氧化酶，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂现蓝色，加终止液变黄。在450 nm处测OD值，二胺氧化酶浓度与OD450值之间呈正比，可通过绘制标准曲线求出标本中的二胺氧化酶浓度。I-FABP的方法原理同DAO的检测方法。

1.4.2 组织增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白 采用Western blotting法。具体步骤：①小肠组织总蛋白提取，在冰上配置裂解液，体积比为RIPA∶cocktail∶PMSF=100∶2∶1，超声裂解小肠组织，裂解液12 000 g，4 ℃离心5 min。②BCA法测定蛋白浓度，比色分析，测定595 nm处的OD值。于Excel表中根据标准品绘制标准曲线，根据得出的公式计算样本浓度。③SDS-PAGE电泳。④转膜。⑤封闭：膜用TBST冲洗干净，将膜用移至含有脱脂牛奶的平皿中摇床上室温封闭1.5 h。⑥孵育一抗，从封闭液中取出膜，用TBST清洗3次，每次5 min。将一抗PCNA(1∶2 000)，GAPDH(1∶8 000)用封闭液稀释至适当浓度。⑦孵育二抗，选择和一抗种属相对应的二抗，室温孵育1.5 h。用TBST在室温下脱色摇床上分别清洗10、5、5 min，3次。免疫反应条带在奥德赛双色红外激光扫描系统(LI-COR Biosciences)上显示。蛋白定量采用Image Pro 6.0软件对条带进行扫描定量，统计灰度值的结果。

1.5 大鼠小肠组织腺窝深度、绒毛高度观察及上皮细胞凋亡数计数

1.5.1 组织腺窝深度、绒毛高度 将小肠组织切成厚薄为14 μm的切片，并行HE染色，光学显微镜下观察腺窝深度、绒毛高度，评估小肠病理损害程度。

1.5.2 组织上皮细胞凋亡数 采用末端脱氧核苷酸转移酶dUTP镍端标记法(TUNEL)。具体步骤：①石蜡切片脱蜡，依次将切片放入二甲苯Ⅰ、20 min，二甲苯Ⅱ、20 min，无水乙醇Ⅰ、10 min，无水乙醇Ⅱ、10 min，85%酒精、10 min，75%酒精、10 min，蒸馏水。②修复，切片稍微甩干后用组化笔在组织周围画圈，在圈内滴加蛋白酶K工作液覆盖组织，37 ℃温箱孵育25 min，稍后用PBS(pH7.4)清洗3次，每次5 min。③破膜，将切片稍微甩干后在圈内加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20 min，稍后用PBS(pH7.4)清洗3次，每次5 min。④加试剂1、2，取Tunel试剂盒内适量试剂1(TdT)和试剂2(dUTP)按1∶9混合，加到圈内覆盖组织，置于湿盒内37 ℃温箱孵育2 h。⑤DAPI复染细胞核，切片用PBS(pH7.4)洗涤3次，每次5 min。稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10 min。最后封片观察。有荧光表达的为凋亡细胞。

1.6 大鼠小肠组织IL-1β、TNF-α、IL-1Ra、IL-10检测 取小肠组织匀浆液，以3 000 r/min的速度离心10 min，取上清液，利用ELISA检测试剂盒检测。具体步骤：①ELISA试剂盒实验前在室温下平衡20 min后再从铝箔袋中取出所需板条。②设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL。③样本孔中加入待测样本50 μL，空白孔不加。④除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100 μL，用封板膜封住反应孔，37 ℃水浴锅或恒温箱温育60 min。⑤弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液(350 μL)，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。⑥每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min。⑦每孔加入终止液50 μL，15 min内在450 nm波长处测定各孔的OD值。为了保证实验结果的准确性，每种炎症因子均检测3次，最后取平均值作为最终结果。

1.7 大鼠小肠组织TLR4、NF-κB P65阳性细胞数及蛋白检测

1.7.1 TLR4、NF-κB P65阳性细胞数 采用免疫荧光染色法。具体步骤：①石蜡切片脱蜡，依次将切片放入二甲苯Ⅰ、15 min，二甲苯Ⅱ、15 min，无水乙醇Ⅰ、5 min，无水乙醇Ⅱ、5 min，85%酒精、5 min，75%酒精、5 min，蒸馏水。②抗原修复，将石蜡切片脱水后于EDTA抗原修复缓冲液(pH8.0)中在微波炉中进行抗原修复，中火8 min，停火8 min，转中低火7 min。修复过程中防止干片，自然冷切后置于PBS(pH7.4)中洗涤3次，每次5 min。③用组化笔在组织周围画圈，用BSA封闭30 min。④加一抗，一抗TLR4(1∶200)，P-P65(1∶100)。轻轻甩掉封闭液，加一抗后置于湿盒内4 ℃孵育过夜。⑤加二抗，荧光二抗CY3山羊抗兔(1∶300)。PBS洗涤3次，每次5 min。加二抗后避光室温孵育50 min。⑥DAPI复染细胞核，再用PBS洗涤3次，每次5 min，加DAPI染液，避光室温孵育10 min。最后封片观察。

1.7.2 TLR4、NF-κB P65蛋白 采用Western blotting法，具体步骤参照“1.4.2”方法。

2 结果

2.1 各组血清DAO、I-FABP水平及组织PCNA蛋白表达量比较 血清DAO、I-FABP水平及组织PCNA蛋白表达量比较见表1。

表1 各组血清DAO、I-FABP水平及组织PCNA蛋白表达量比较

注：与对照组比较，▲P<0.05；与模型组比较，★P<0.05。

2.2 各组小肠组织黏膜腺窝深度、绒毛高度比较 小肠组织黏膜腺窝深度、绒毛高度比较见表2。

表2 各组小肠组织黏膜腺窝深度、绒毛高度比较

注：与对照组比较，▲P<0.05；与模型组比较，★P<0.05。

2.3 各组小肠组织上皮细胞凋亡数比较 干预组、模型组、对照组小肠上皮细胞凋亡数分别为(10.5±1.1)、(118.4±5.0)、(50.38±3.2)个/104μm2，模型组与对照组比较，干预组与模型组比较，P均<0.05。

2.4 各组小肠组织IL-1β、TNF-α、IL-1Ra、IL-10表达量比较 组织IL-1β、TNF-α、IL-1Ra、IL-10表达量比较见表3。

表3 各组小肠组织IL-1β、TNF-α、IL-1Ra、IL-10表达量比较

注：与对照组比较，▲P<0.05；与模型组比较，★P<0.05。

2.5 各组小肠组织TLR4、NF-κB P65阳性细胞数及蛋白表达量比较 组织TLR4、NF-κB P65阳性细胞数及蛋白表达量比较见表4。

表4 各组小肠组织TLR4、NF-κB P65阳性细胞数及蛋白表达量比较

注：与对照组比较，▲P<0.05；与模型组比较，★P<0.05。

3 讨论

OJ发生时，肠黏膜屏障功能障碍是胃肠道主要的病理改变。这是由于肠道胆汁缺乏、肠道菌群失衡、氧化应激、肠黏膜萎缩、肠上皮细胞间的紧密连接被破坏所致[1,10]。其次，OJ会导致胃肠道平滑肌张力降低，蠕动减弱，消化腺萎缩分泌减少，出现腹胀、便秘、消化吸收不良的症状。所以，保护OJ肠功能对临床治疗很有意义。对OJ肠功能的保护还处于研究阶段，临床上还没有特异性的保护OJ肠功能的药物。刘俊等[11]发现，前列腺素E1对OJ肠黏膜屏障有保护作用，可减少内毒素血症的发生，对改善预后有一定得作用。重组人生长激素可影响OJ肠黏膜IL-18表达从而改善肠黏膜屏障功能[12]。黄芩苷能抑制OJ大鼠肠道炎性反应，减轻肠黏膜损伤，保护肠黏膜屏障的功能[13]。在临床上，采用蛋白质型制剂的肠内营养(EN)可保护患者肠黏膜屏障功能，促进胃肠肝脏功能恢复，改善机体免疫功能有积极作用，可显著减少并发症，降低病死率[14]。

黄芪含有黄芪皂苷、多糖、蛋白质、黄酮等有效成分，多糖是黄芪的水溶性主要成分之一[4]。APS由阿拉伯糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖和葡萄糖组成，具有抗氧化、免疫调节、抗肿瘤、抗炎等多种生理功能[5～9]。文献[15]报道，APS可抑制胃癌MGC-803细胞、人非小细胞肺癌A549细胞、人肝癌HepG2细胞。在胃癌治疗上，放疗结合APS治疗可明显减小肿瘤体积[16]。APS治疗哮喘可降低痰液细胞炎症水平、恢复肺功能，还能通过调节患者免疫功能、减少炎症反应、改善老年患者早期糖尿病肾病的肾功能[17,18]。OJ随病程进展可出现明显损伤肠道，小肠上段的病理改变可发现OJ肠黏膜绒毛稀疏、高度减低伴有明显的水肿且排列紊乱，上皮细胞部分坏死脱落，可见炎性细胞浸润。其次，OJ可导致肠黏膜屏障受损，而血清DAO及I-FABP两个指标可反应肠黏膜屏障功能。OJ 14 d后血清这两项指标要明显高于对照组。除此之外，OJ影响小肠上皮细胞再生、促进凋亡。PCNA与细胞DNA合成密切相关，在细胞增殖中发挥重要作用，是细胞增殖的指标，OJ可以使小肠组织PCNA蛋白表达下降，凋亡增多。

APS干预后可明显抑制OJ肠组织促炎因子TNF-α、IL-1β的表达，上调促进抗炎因子IL-10、IL-Rα的表达。TNF-α和其他炎性细胞因子共同作用可引起严重的肠损伤。IL-1β的过表达参与机体急性和慢性炎症反应，并且是促进其他促炎因子分泌的关键因子[19]。为了进一步探究维持这种炎性平衡的可能机制，我们发现肠组织TLR4蛋白表达增高，TLR4介导炎症反应具有重要意义。有研究表明，APS可激活TLR依赖的MyD88信号通路来调节机体的免疫功能[9]，还可通过抑制促凋亡和调节PI3K/AKT/mTOR信号通路来减轻IL-1β刺激成纤维滑膜细胞的促炎作用[20]。Vieira等[21]利用肠上皮细胞培养模型加入TNF-α细胞因子可显著增加一氧化氮、单核细胞化学引诱物蛋白1、血管内皮生长因子、IL-8、细胞间黏附分子1和活性氧的含量。TNF-α和其他炎性细胞因子共同作用可引起严重的肠损伤。IL-1β的过表达参与机体急性和慢性炎症反应，并且是促进其他促炎因子分泌的关键因子[22]。Sablet等[23]发现，TNF-α和IL-1β在通过促进Ly6c+炎性细胞增殖和浸润导致肠道屏障功能损中起关键作用。IL-1Ra具有广谱抗炎作用。抗炎因子IL-1Ra可通过抑制P53依赖的凋亡，保护肠隐窝上皮细胞，减轻肠黏膜炎症反应[24]。本研究在APS干预后，大鼠小肠组织促炎因子TNF-α、IL-1β水平明显降低，小肠组织的抗炎因子IL-10、IL-Rα水平显著升高，可保护OJ肠功能。

总之，APS可通过TLR4/NF-κB P65通路调节小肠促炎与抗炎因子的平衡、减轻OJ大鼠小肠炎症反应、减少细胞凋亡、维持肠道细胞增殖活性、降低肠道通透性、保护肠道功能。