胃肠道间质瘤组织中FAM96A、FAM96B、Caspase3表达观察

杨道丽，成元华，张亚娟，成元冬，龚灵

1贵州医科大学，贵阳 550004；2贵州医科大学附属医院；3贵州省肿瘤医院

胃肠道间质瘤(GIST)是胃肠道最常见的间叶源性肿瘤，大多数病例存在CKIT基因或PDGFRA基因活化突变[1]。目前，针对GIST最有效的治疗手段是根治性手术切除和分子靶向药物治疗，但完整手术切除的患者仍可能发生转移[2]。对不能切除或复发、转移的GIST患者，使用分子靶向药物是首选的治疗方法[3]，但易出现耐药，使高复发风险的患者难以获得长期生存。96序列相似的家庭成员A(FAM96A)是广泛表达且高度保守的小分子凋亡激活蛋白，FAM96B是小分子蛋白，两者属同源蛋白，约50%的序列相同，其肽链中间均为DUF59结构域，含有该结构域的蛋白可能与铁硫簇蛋的白组装及DNA修复等功能相关[4～6]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)家族是凋亡的重要调节因素，Caspase3作为Caspase家族中最关键的成员，是凋亡的执行者，也是凋亡细胞Caspase级联反应必经的共同通路[7,8]。细胞凋亡可以通过内源性途径和外源性途径诱导[9]，其中内源性细胞凋亡途径是线粒体介导的半胱天冬酶激活途径，又称线粒体通路。Schwamb等[10]首次提出FAM96A抑制肿瘤发生发展的具体机制可能与线粒体凋亡途径有关，并且发挥该功能的区域为FAM96A中的DUF59结构域，FAM96A基因缺失在GIST形成过程中起重要作用。FAM96B和FAM96A为同源蛋白，二者均含DUF59结构域，推测FAM96B也与GIST的发生发展有关，也可能通过线粒体凋亡途径有效诱导GIST肿瘤细胞的凋亡，而Caspase3作为凋亡细胞Caspase级联反应必经的共同通路。本研究观察了GIST组织中FAM96A、FAM96B、Caspase3蛋白及FAM96A、FAM96B mRNA表达变化，旨在为进一步了解GIST的发生发展机制及探索新的治疗方法提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2014年9月～2018年9月贵州医科大学附属医院收治的GIST患者120例，男48例，女72例；年龄29～82岁，中位年龄59岁；年龄≤59岁71例，>59岁49例；肿瘤发生部位位于胃81例，肠31例，胃肠外8例；肿瘤直径≤5 cm 56例，>5 cm 64例；核分裂像≤5/50 HPF 93例，>5/50HPF 27例；依据GIST核分裂像多少及肿瘤直径进行危险度分级[11]，其中极低和低危险度分级49例，中危险度分级32例，高危险度分级39例。手术留取GIST组织140例份(120例份用于免疫组化检测、20例份用于RT-PCR检测，分别记为肿瘤1组、肿瘤2组)和正常组织130例份(120例份用于免疫组化检测、10例份用于RT-PCR检测，分别计正常1组、正常2组)。

1.2 GIST组织中FAM96A、FAM96B、Caspase3蛋白检测 采用免疫组化EnVision二步法。FAM96A、FAM96B、Caspase3抗体稀释度分别为1∶800、1∶600及1∶500。FAM96A与FAM96B用柠檬酸盐溶液(pH6.0)高温高压抗原修复，Caspase3用 EDTA(pH9.0)高温高压抗原修复；修复时间均为3 min。严格按照常规免疫组化方法染色，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染细胞核，PBS代替一抗作为空白对照。FAM96A、FAM96B、Caspase3蛋白的阳性表达均定位于细胞质，呈棕黄色或棕褐色颗粒。使用软件Imageproplus分析光密度法(积分光密度值IOD/区域面积ARE)对免疫组化染色结果进行定量分析；采用镜下阳性细胞数占肿瘤细胞总数的百分率和肿瘤细胞着色强度综合进行定性分析。依照阳性细胞所占比例，占<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%分别记为0、1、2、3、4分；依照着色强度，未着色计0分，浅黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分；将二者得分相乘后取5个视野得分的平均值记为最终分数，根据最终分数分成4种等级，0～1分为-，2～4分为+，5～8分为++，9～12分为+++，将++和+++定义为阳性。

1.3 GIST组织中FAM96A、FAM96B mRNA检测 采用RT-PCR法检测。FAM96A及FAM96B基因引物用Primer5.0引物软件自行设计，基因引物及β-actin内参引物均由上海生工生物工程有限公司合成，FAM96A：5′-GGTCTCGGAAAGTTGTGTGGA-3′，5′-CAGCCCAATA-AGAGTCGCCA-3′；FAM96B：5′-ACAGTGGCTGTGGCTT-TCAC-3′，5′-AGCGCAAAGCTTGACCTTG-3′；β-actin：5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3′，5′-GGGCCGGACTCGTCA-TAC -3′。根据石蜡包埋组织RNA提取试剂盒说明书进行操作，提取出组织总mRNA，用核酸定量仪测量总RNA浓度和纯度，取吸光度比值(A260/A280)在1.8～2.0的样本进行后续实验。按照逆转录试剂盒使用说明书合成cDNA，将逆转录合成的cDNA置-20 ℃保存备用。RT-PCR总反应体系25 μL：SYBR Green 12.5 μL，上下引物各1 μL(浓度均为10 μmol/L)，cDNA 2 μL，焦碳酸二乙酯水调节至总体积25 μL。反应条件为变性、退火及延伸，设定40个循环。本实验中FAM96A、FAM96B及β-actin总反应体系和反应条件均相同，由RT-PCR仪自动生成数据，得出Ct值，以2-ΔΔCt代表FAM96A、FAM96B mRNA相对表达量。

2 结果

2.1 两组FAM96A、FAM96B、Caspase3蛋白阳性率比较 肿瘤1组和正常1组FAM96A蛋白阳性率分别为14.2%(17/120)、91.7%(110/120)，FAM96B蛋白阳性率分别为21.7%(26/120)、89.2%(107/120)，Caspase3蛋白阳性率分别为65.0%(78/120)、90.0%(108/120)，两组比较，P均<0.05。

2.2 FAM96A、FAM96B、Caspase3蛋白表达与GIST临床病理参数的关系 结果见表1，由表1可知，FAM96A、FAM96B蛋白阳性表达与肿瘤1组GIST肿瘤直径、危险度分级有关(P均<0.05)，与患者性别、年龄、发生部位、核分裂像无相关性(P均>0.05)；Caspase3蛋白阳性表达与GIST患者性别、年龄、发生部位、肿瘤直径、核分裂像、危险度分级均无相关性(P均>0.05)。

表1 FAM96A、FAM96B、Caspase3蛋白表达与GIST临床病理参数的关系

2.3 GIST组织中FAM96A、FAM96B、Caspase3蛋白表达的相关性 Spearman等级相关分析结果显示，肿瘤1组GIST组织中FAM96A、FAM96B蛋白表达与Caspase3蛋白表达均无相关性(P均>0.05)。

2.4 两组FAM96A、FAM96B mRNA相对表达量比较 肿瘤2组、正常2组FAM96A mRNA相对表达量分别为0.55±0.23、1，FAM96B mRNA相对表达量分别为1.22±0.66、1，两组FAM96A mRNA相对表达量比较，P<0.05。

3 讨论

GIST是胃肠道最常见的间叶源性肿瘤，占全部胃肠道恶性肿瘤的2%～3%[12]。尽管伊马替尼等分子靶向药物已经成为手术后、不可切除的及转移性GIST的首选治疗药物，并使患者获得较长的无进展生存(PFS)和较高的总生存(OS)，但耐药现象和不良反应仍不能避免[13]。伊马替尼出现耐药后，临床上应用二线药物舒尼替尼和三线药物瑞戈非尼治疗，但治疗效果都没有达到或接近伊马替尼，且不良反应也比较明显，甚至有研究报道采用舒尼替尼和瑞戈非尼快速交替的治疗方案，但治疗结果未见报道[14]。文献[15]报道，大多数GIST患者出现耐药的最常见原因是基因发生再突变或多基因突变。肿瘤形成过程中发生了复杂的分子变化，包括原癌基因激活、肿瘤抑制基因的灭活或丢失、凋亡调节基因和DNA修复基因功能紊乱。癌基因和抑癌基因作用失衡是恶性肿瘤发生发展的关键环节。因此，对某些具有潜在调控作用的基因进一步研究是有必要的，可为肿瘤发生发展机制提出新的见解及探索新的诊疗方法提供理论依据。

FAM96A、FAM96B能与铁硫(Fe/S)辅助因子结合参与铁稳态调节，Fe/S蛋白在DNA复制和修复、染色体分离及核糖体蛋白翻译过程中起重要作用[4]。Yang等[16]认为，FAM96B作为碱性螺旋-环-螺旋蛋白E2-2的调节基因，在血管内皮细胞的增殖、迁移和微管形成中发挥重要作用。Chen等[17]发现，FAM96B和硒蛋白W结合与大脑发育和神经退行性病变有关，能导致细胞周期停滞，进而启动DNA损伤修复，并维持基因组稳定性。研究[18]显示，保守的DUF59结构域与维持基因组稳定性有关。以上研究提示，FAM96A和FAM96B在细胞增殖中起着重要作用。国内部分研究已经证实，FAM96A和FAM96B在消化道上皮源性恶性肿瘤(如胃癌及肝癌等)中呈低表达，过表达的FAM96A和FAM96B能抑制肿瘤细胞增殖，并诱导其凋亡，有望成为恶性肿瘤潜在的诊断和治疗靶点[19～21]。Schwamb等[10]发现，FAM96A通过线粒体凋亡通路能有效诱导GIST细胞的凋亡，该蛋白在大多数GIST中表达显著降低。本研究显示，FAM96A、FAM96B蛋白在GIST肿瘤组织中的表达较正常组织中减少，FAM96A mRNA在GIST肿瘤组织中的表达量较正常组织减少。研究[19～21]发现，FAM96A、FAM96B表达与胃癌、结肠癌、肝癌等的发生发展、侵袭、转移相关。本文结果显示，FAM96A、FAM96B蛋白表达与GIST的肿瘤直径、危险度分级有关，提示FAM96A、FAM96B在GIST的发生发展过程中有一定作用，随着肿瘤直径增大和(或)危险度分级增高，其表达减少甚至缺失。本研究只对30例蜡块组织进行FAM96A、FAM96B mRNA的定量进行研究，考虑样本量较小，故未在分子层面分析二者与GIST患者的临床病理参数之间的关系。此外，FAM96B mRNA在GIST肿瘤组织中的表达量与正常组织中无差异，这与既往报道的胃肠道上皮源性恶性肿瘤的表达情况不一致，分析可能与石蜡包埋组织RNA降解明显、GIST间质中的血管也表达FAM96B蛋白、本实验样本量相对较小及肿瘤类型不同等因素有关。

Caspase3作为细胞凋亡途径的主要执行者，在大多数凋亡事件中高表达，是凋亡过程重要的调节基因，其表达情况用于评估细胞凋亡水平[22～24]。本研究显示，Caspase3蛋白在GIST肿瘤组织中的表达较正常组织减少，推测Caspase蛋白表达的降低与GIST的发生有一定关系。文献[10]报道，FAM96A通过线粒体凋亡通路有效诱导GIST细胞的凋亡，而FAM96A、FAM96B的一级结构有50%序列相同，两者的已知功能相似，提示FAM96B也可能通过线粒体凋亡通路诱导细胞凋亡。本研究对FAM96A、FAM96B蛋白与凋亡关键蛋白Caspase3的相关性进行了分析，结果显示FAM96A、FAM96B蛋白表达与Caspase3蛋白表达均无相关性，考虑到凋亡途径步骤复杂、受多基因共同调控及Caspase3是多条凋亡途径的共同下游效应成分，同时考虑本实验样本量相对较小等因素，关于FAM96A和FAM96B在GIST肿瘤组织中表达减少的具体机制还需深入研究。本研究旨在研究GIST中FAM96A及FAM96B的表达情况，并进一步探讨FAM96A及FAM96B在GIST中发挥生物功能机制是否与线粒体凋亡途径有关，故未研究Caspase3 mRNA在GIST肿瘤组织中的表达情况。

总之，FAM96A、FAM96B、Caspase3在GIST组织中呈低表达，FAM96A和FAM96B可能作为新的抑癌基因，其表达的减少甚至缺失可能抑制了GIST肿瘤细胞的凋亡，这为临床提供了新的治疗靶点和思路。