miR-20a-5p靶向调控BRMS1L对人结直肠癌细胞株SW480增殖、凋亡能力的影响及其机制探讨

陈杰

湖南省肿瘤医院，长沙 410000

结直肠癌是临床常见的消化道恶性肿瘤，常发生在直肠和乙状结肠交界处，发病率在人体恶性肿瘤中居第三位[1]。结直肠癌起病隐匿，易转移，预后较差，病死率较高。因此，探讨发病机制结直肠癌对早期诊断、个体化治疗、提高治疗效果、改善患者生存和预后具有重要意义。微小RNA(miRNA)作为一种内源性RNA，其通过靶向mRNA在转录后水平进行翻译抑制或降解调节基因表达，调节细胞生长、分化、增殖和凋亡[2]。多项研究[3～5]表明，miRNA可作为抑癌基因或癌基因发挥作用，参与包括结直肠癌在内的多种肿瘤的发生、进展和耐药等生物学过程。微小RNA-20a-5p(miR-20a-5p)是一种常见的miRNA，其在结直肠癌中表达上调，并发挥致癌基因的功能[6,7]。然而，miR-20a-5p在结直肠癌发生发展中的生物学作用和确切机制仍不清楚。生物信息学分析显示，乳腺癌转移抑制基因1(BRMS1L)是miR-20a-5p的潜在功能性靶基因之一，BRMS1L是一种新的抑癌基因，在卵巢癌和乳腺癌中表达下调，上调其表达可抑制癌细胞的侵袭和转移[8,9]。然而，miR-20a-5p靶向BRMS1L是否参与结肠癌进展尚未可知。本研究观察了miR-20a-5p靶向调控BRMS1L对人结直肠癌细胞株SW480增殖、凋亡能力的影响，并探讨其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株、转染物及主要试剂 人结直肠癌细胞株SW480、DLD-1、HCT116及正常结直肠黏膜细胞株FHC购自中国科学院上海细胞库。miR-20a-5p抑制物(anti-miR-20a-5p)、miR-20a-5p抑制物阴性对照(anti-miR-NC)、BRMS1L过表达载体(pcDNA-BRMS1L)、BRMS1L过表达载体阴性对照(pcDNA-NC)、miR-20a-5p模拟物(miR-20a-5p mimics)、miR-20a-5p模拟物阴性对照(miR-NC)及BRMS1L小干扰RNA阴性对照(si-NC)、BRMS1L小干扰RNA(si-BRMS1L)购自上海吉玛制药技术有限公司；含有miR-20a-5p结合位点的BRMS1L-3′UTR野生型(WT-BRMS1L)及突变型(MUT-BRMS1L)报告基因载体的构建由南京诺唯赞生物科技公司提供。DMEM-12、DMEM、RPMI1640培养基和胎牛血清购自美国Hyclone公司；LipofectamineTM2000购自美国Thermo公司；TRIzol试剂、细胞计数试剂盒(CCK-8)、膜联蛋白V异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)细胞凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝生物科技公司；兔抗BRMS1L、细胞周期素D1(CyclinD1)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved-Caspase-3)、β-连环蛋白(β-catenin)抗体购自美国Abcam公司；山羊抗兔Ⅱ抗购于上海碧云天公司。

1.2 结肠癌细胞株的选择 采用qRT-PCR法和Western blotting法检测FHC、SW480、DLD-1、HCT116细胞中miR-20a-5p mRNA和BRMS1L mRNA、蛋白。FHC、SW480、DLD-1、HCT116细胞中miR-20a-5p mRNA分别为1.00±0.10、3.22±0.32、3.01±0.30、2.35±0.24，BRMS1L mRNA分别为1.02±0.11、0.35±0.04、0.44±0.05、0.30±0.03，BRMS1L蛋白分别为1.04±0.12、0.33±0.03、0.42±0.04、0.45±0.05，SW480、DLD-1、HCT116细胞与FHC细胞比较，P均<0.05。SW480与FHC细胞比较差异最为显著，根据以上结果，选择SW480细胞作为本研究的实验细胞。

1.3 SW480细胞anti-miR-20a-5p、pcDNA-BRMS1L转染 取SW480细胞，将细胞接种到6孔板，当细胞密度达到60%时利用脂质体LipofectamineTM2000进行转染，A、B、C、D、E、F组分别转染anti-miR-20a-5p、anti-miR-NC、pcDNA-BRMS1L、pcDNA-NC、anti-miR-20a-5p+si-BRMS1L、anti-miR-20a-5p+si-NC，6 h后换液，转染48 h，转染合格后，取上述各组细胞进行后续实验。

1.4 转染anti-miR-20a-5p、pcDNA-BRMS1L的SW480细胞增殖能力观察 ①存活率：采用CCK-8法。将A、B、C、D、E、F组SW480细胞按照每孔3 000接种96孔板，培养48 h后，每孔加入10 μL的CCK-8试剂，培养箱孵育2 h。检测450 nm的吸光度值(A值)，以空白孔调零，结果以细胞存活率表示，细胞存活率=(对照组A值/实验组A值)×100%。②CyclinD1蛋白：采用Western blotting法。将A、B、C、D、E、F组SW480细胞接种到6孔板，细胞密度为80%时，采用Western blotting法检测细胞中CyclinD1蛋白。CyclinD1蛋白相对表达量=CyclinD1灰度值/β-actin灰度值。

1.5 转染anti-miR-20a-5p、pcDNA-BRMS1L的SW480细胞凋亡能力观察 ①凋亡率：采用Annexin V-FITC/PI双染法。将A、B、C、D、E、F组SW480细胞接种到6孔板，细胞密度为80%时，用胰蛋白酶消化各组细胞，离心收集细胞沉淀，添加500 μL的结合缓冲液，加入Annexin V-FITC和PI染液各5 μL，用流式细胞仪检测细胞凋亡变化，结果以细胞凋亡率表示。②Cleaved-Caspase-3蛋白：检测方法参照“1.4”中CyclinD1蛋白的检测方法。

1.6 转染anti-miR-20a-5p、pcDNA-BRMS1L的SW480细胞β-catenin蛋白检测 检测方法参照“1.4”中CyclinD1蛋白的检测方法。

1.7 miR-20a-5p与BRMS1L之间靶向关系、调控作用验证 ①靶向关系：采用双荧光素酶报告基因实验。将miR-20a-5p mimics、miR-NC分别与WT-BRMS1L或MUT-BRMS1L共转染至SW480细胞(分别记为G、H组)，转染48 h，采用双荧光素酶报告基因检测系统检测两组细胞荧光素酶活性。②调控作用：采用Western blotting法。将SW480细胞接种到6孔板，当细胞密度达到60%时，将miR-20a-5p mimics、miR-NC、anti-miR-20a-5p、anti-miR-NC分别转染SW480细胞(分别记为I、J、K、L组)，48 h后采用Western blotting法检测BRMS1L蛋白。

2 结果

2.1 各组细胞存活率、凋亡率及CyclinD1、Cleaved-Caspase-3蛋白相对表达量比较 细胞存活率、凋亡率及CyclinD1、Cleaved-Caspase-3蛋白相对表达量比较见表1。

表1 各组细胞存活率、凋亡率及CyclinD1、Cleaved-Caspase-3蛋白相对表达量比较

注：与B组比较，*P<0.05；与D组比较，△P<0.05；与F组比较，﹟P<0.05。

2.2 各组β-catenin蛋白相对表达量比较 A、B、C、D、E、F组β-catenin蛋白相对表达量分别为0.36±0.04、0.72±0.07、0.42±0.03、0.70±0.06、0.60±0.06、0.34±0.03，anti-miR-20a-5p组、anti-miR-NC组比较，pcDNA-BRMS1L组、pcDNA-NC组比较，anti-miR-20a-5p+si-BRMS1L组、anti-miR-20a-5p+si-NC组比较，P均<0.05。

2.3 各组细胞荧光素酶活性及BRMS1L蛋白相对表达量比较 两组细胞荧光素酶活性比较见表2。I、J、K、L组BRMS1L蛋白相对表达量分别为0.12±0.01、0.36±0.04、0.82±0.08、0.38±0.05，I、J组比较，K、L组比较，P均<0.05。

表2 两组细胞WT-BRMS1L、MUT-BRMS1L相对荧光素酶活性比较

注：与H组比较，*P<0.05。

3 讨论

结直肠癌又叫大肠癌，是指大肠上皮来源的癌症，好发于40岁以上的中老年人，且男性多于女性，多数患者后期可出现大便性状改变、便血和腹痛。虽然外科手术治疗、术后放化疗、靶向治疗等综合治疗手段不断改善，但每年全球新增结肠癌患者高达100万例，且死亡人数超过69万例[1]，是亟待解决的全球公共卫生问题。结直肠癌细胞株SW480、DLD-1、HCT116是研究结直肠癌常用的体外细胞模型，本研究通过探讨人正常结直肠黏膜细胞株FHC和结直肠癌细胞株DLD-1、HCT116、SW480中miR-20a-5p和BRMS1L表达变化，选取miR-20a-5p表达最高、BRMS1L表达较低的SW480细胞进行功能试验，并探讨miR-20a-5p和BRMS1在结直肠癌细胞增殖和凋亡中的作用，以期为结直肠癌防治提供新的策略。

miRNA作为人类疾病的重要参与者，其在包括结肠癌在内的多种肿瘤中表达失调并参与细胞增殖失控、凋亡抑制和促进侵袭转移过程地调控。miR-20a-5p是一种致癌基因，既往研究显示肝癌[10]、三阴性乳腺癌[11]中miR-20a-5p呈高表达，其高表达促进了肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭。然而，在神经母细胞瘤中,miR-20a-5p却表达下调，并发挥抑癌基因作用[12]。BRMS1与组蛋白去乙酰化酶、特定的转录因子形成复合物，从而调节转移相关基因的表达，抑制多种肿瘤类型的转移。研究[13]显示，BRMS1在结肠癌中表达降低，检测BRMS1是判断结肠癌转移和预后情况的重要指标。BRMS1L是BRMS1的类似物，腺癌组织中BRMS1L的表达降低与转移以及患者较差的生存相关，BRMS1L通过诱导FZD10表观遗传沉默抑制乳腺癌转移[14]。在胶质瘤中，BRMS1L表达降低与高级别胶质瘤以及生存分析中较高的病死率显著相关[15]。miR-934通过靶向BRMS1L促进卵巢癌细胞增殖，抑制细胞凋亡[16]。miR-93-5p通过靶向BRMS1L调控Wnt信号通路促进泪腺腺样囊性癌的发生[17]。本研究通过功能缺失、获得实验分析miR-20a-5p和BRMS1L在结直肠癌细胞增殖、凋亡中的作用，发现抑制miR-20a-5p表达、过表达BRMS1L均可降低SW480细胞存活率，并升高细胞凋亡率。同时双荧光素酶报告实验证实，BRMS1L是miR-20a-5p的靶基因，miR-20a-5p可在蛋白水平负性调控BRMS1L表达。此外恢复实验显示，抑制BRMS1L表达还可部分逆转抑制miR-20a-5p对SW480增殖和凋亡的影响。以上研究说明，miR-20a-5p通过靶向BRMS1L在结直肠癌进展中发挥作用。

CyclinD1又叫G1/S-特异性周期蛋白-D1，其通过激活G1期特有的周期蛋白依赖性激酶，促进G1周期抑制蛋白的磷酸化，推动细胞周期向S期过渡，其过度表达可致细胞增殖失控而恶性化，是目前公认为原癌基因[18～20]。研究显示，上调miR-20a-5p表达可有效降低肾小管上皮细胞中CyclinD1表达，诱导G1期阻滞，抑制细胞增殖[21]。Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，Caspase-3的活化可引起细胞不可逆凋亡[22]。本研究发现，抑制miR-20a-5p表达、过表达BRMS1L均可降低SW480细胞中CyclinD1蛋白表达，升高Cleaved-Caspase-3蛋白的表达，且抑制BRMS1L表达还可部分逆转抑制miR-20a-5p对SW480细胞CyclinD1蛋白和Cleaved-Caspase-3蛋白表达的影响。说明抑制miR-20a-5p通过靶向上调BRMS1L可有效抑制结肠癌细胞增殖，诱导细胞凋亡。

Wnt/β-catenin信号通路是一条经典的Wnt信号通路，在多数情况下，β-catenin的过度活化可诱导肿瘤发生。研究[23～25]显示，在多种结直肠癌中肿瘤抑制基因的突变可阻碍β-catenin的降解和磷酸化，引起β-catenin在细胞核聚集，结合T细胞转录因子和淋巴细胞增强因子，促进下游原癌基因表达，而抑制Wnt/β-catenin信号通路活化对肿瘤细胞的增殖、侵袭和耐药有明显的抑制作用，提示Wnt/β-catenin信号通路是结直肠癌的潜在治疗靶点。本研究发现，抑制miR-20a-5p表达、过表达BRMS1L均可抑制Wnt/β-catenin信号通路活化，而抑制BRMS1L表达还可部分逆转抑制miR-20a-5p对Wnt/β-catenin信号通路的影响。提示miR-20a-5p通过靶向BRMS1L表达参与结直肠癌进展和调控Wnt/β-catenin信号通路有关。

总之，抑制miR-20a-5p通过靶向BRMS1L可抑制结直肠癌细胞增殖，并促进细胞凋亡，机制可能与其抑制Wnt/β-catenin信通路有关。