丹红注射液静注对大鼠肾病的治疗作用及其可能机制

郭小云，李洪钧，李荣

天津医科大学第二医院，天津300211

肾病综合征(NS)是因多种肾脏病理损害所致的严重蛋白尿及其引起的一组临床表现，主要表现为大量蛋白尿(≥3.5 g/d)、低白蛋白血症(≤30 g/L)、高脂血症和明显水肿。一些NS的患者甚至可进展至终末期肾病，给家庭和社会带来沉重的负担。生长分化因子(GDF-15)是TGF-β超家族成员之一[1]，人们发现在许多不同的病理条件下GDF-15在心脏和肾脏的表达上调[2]。近期研究[3]发现，慢性肾脏病患者的GDF-15的表达与肾脏病进展相关[4,5]，是独立于包括尿微量白蛋白肌酐比值(ACR)在内的其他肾脏疾病进展的风险因素[6]。丹红注射液是一种中成药，具有疏通脉络，活血化瘀等效果。近期研究[7]发现，丹红可以通过调节前列环素的合成，升高血浆一氧化氮水平，起到保护内皮细胞的作用。而多项临床研究[8,9]也发现，丹红注射液可以显著减少NS患者的尿蛋白。但是关于丹红注射液能否延缓肾功能进展、肾脏纤维化方面尚无相关研究。本研究观察了丹红注射液静注对大鼠肾病的治疗作用，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 药物及主要试剂 丹红注射液(山东步长制药有限公司)；氯沙坦钾(默沙东公司)。GDF-15 ELISA试剂盒(CSB-E16317r CUSABIO)；抗GDF-15多克隆抗体(bs-3818R)；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(bs-0295G-HRP，北京博奥森生物技术有限公司)；β-actin(Abbkine A01010，武汉艾美捷科技有限公司)；TRIzol(Invitrogen，批号15596026)；TIANScript cDNA第一链合成试剂盒(KR104)；SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(FP205)天根生化科技有限公司；尿蛋白定量测试盒(C035-2)、血尿素氮测试盒(C013-1)、血肌酐测试盒(C011-1)、血白蛋白测试盒(A028-1)、血甘油三酯测试盒(A110-2)、血总胆固醇测试盒(A111-2)来自南京建成生物工程研究所。

1.2 实验动物及分组 雄性SD大鼠32只，体质量110～130 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于天津市放射研究所，实验动物许可证号SCXK(京)2016-0006。温度控制在25 ℃左右、湿度控制在70%左右，环境为清洁级。32只大鼠随机分为丹红组、氯沙坦组、模型组、对照组各8只。

1.3 大鼠肾病模型制备及丹红注射液应用方法 丹红组、氯沙坦组、模型组均一次性尾静脉静注6 mg/kg阿霉素制备肾病模型，对照组不制备模型；制模第4周，丹红组静注4 mL/(kg·d)的丹红注射液，氯沙坦组灌胃给予12 mg/(kg·d)的氯沙坦，模型组和对照组灌胃给予12 mg/(kg·d)的生理盐水，连续用药4周。

1.4 尿液尿蛋白及血清白蛋白(Alb)、TG、TC、肌酐、尿素氮、GDF-15和肾组织肾小球硬化指数测算 各组大鼠分别于药物治疗第28天放入代谢笼中，留取24 h尿液，记录尿量，离心后取上清液，采用CBB法检测24 h尿蛋白定量。于第29天处死大鼠，处死前经腹主动脉取血3 mL，采用全自动生化分析仪检测血清白蛋白(Alb)、TG、TC、肌酐、尿素氮，另采用ELISA法检测血清GDF-15，操作步骤均严格按试剂盒说明书进行。处死大鼠，取肾组织约0.4 g，以4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、切片。每组小鼠观察100个肾小球，计算肾小球硬化指数(%)。采用半定量分析法对肾小球硬化程度进行分级，0级：所有肾小球均正常；1级：硬化区域<25%；2级：26%～50%；3级：51%～75%；4级：76%～100%。计算公式：肾小球硬化指数=[(1×n1)+(2×n2)+(3×n3)+(4×n4)]/(n0+n1+n2+n3+n4)，nx为不同硬化程度肾小球的数量。根据Raij等[10]半定量方法评估肾小球硬化程度。

1.5 肾组织GDF-15蛋白、mRNA检测 GDF-15蛋白：采用Western blotting法。取处死大鼠肾脏组织0.1 g，冰上研磨肾皮质，加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，取上清，用考马斯亮蓝法检测各细胞样本蛋白含量，取30 μg蛋白，100 ℃加热变性5 min，加至凝胶孔中，电泳，电转至固相支持物上，然后分别用抗GDF-15多克隆抗体(1∶300)及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1∶3 000)对其进行孵育、检测。用Image J软件分析灰度值。以目的蛋白灰度值与内参灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量。GDF-15 mRNA：采用RT-PCR法。取处死大鼠肾脏组织0.1 g，用TRIzol提取肾组织样本中总RNA。用TIANScript RT KIT进行反转录为cDNA。使用引物对cDNA样品进行扩增。正向和反向引物5′-GACCTAGGTTGGAGCGACTG-3′和5′-CCTGTGCATAAGAACCACCG-3′，mRNA表达量采用β-actin正向和反向引物5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′和5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC -3′矫正，反应条件为95 ℃预变性15 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，×40个循环。分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCT法进行数据的相对定量分析，比较各组间表达的差异。

2 结果

2.1 各组尿液尿蛋白及血清Alb、TG、TC、尿素氮、肌酐水平和肾组织肾小球硬化指数比较 尿液尿蛋白及血清Alb、TG、TC、尿素氮、肌酐水平和肾组织肾小球硬化指数比较见表1。

表1 各组尿液尿蛋白及血清Alb、TG、TC、尿素氮、肌酐水平和肾组织肾小球硬化指数比较

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与氯沙坦组比较，cP<0.05。

2.2 各组血清GDF-15水平及肾组织GDF-15蛋白、mRNA表达量比较 血清GDF-15水平及肾组织GDF-15蛋白、mRNA表达量比较见表2。

表2 各组血清GDF-15水平及肾组织GDF-15蛋白、mRNA表达量比较

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与氯沙坦组比较，cP<0.05。

3 讨论

NS因大量蛋白尿、低蛋白血症、水肿及高脂血症常导致血液浓缩、血液黏稠度增加，血液流速减慢从而导致血管内皮细胞缺氧、损伤。因此，NS患者常存在高凝状态，容易形成血栓发生栓塞进而导致肾功能进展[11]。阿霉素是一类具有足细胞毒性作用的蒽环类抗生素，ADR肾病模型最早于1982年由Bertani等[12]提出，此模型是国内外公认的肾病模型[13]，常用于诱导NS。

丹红注射液主要成分是从丹参和红花中提取出来[14]，丹参和红花中的主要药用成分就是丹红注射液的主要成分。丹参中有效活性成分主要分为两大类，一类为丹参酮类脂溶性化合物，另一类为丹参酚酸类水溶性化合物。而红花的主要有效活性成分包括黄酮类化合物，如红花黄色素等[15]。由于丹参具有活血、养血的作用，而红花具有活血化瘀的效果，丹参和红花同时使用，可以加强改善肾脏血液循环、抑制血小板聚集、保护血管内皮以及抗氧化作用等功效[16～18]，对改善高粘血症、肾小球局部高凝、改善肾小球滤过有肯定疗效。所以，丹红注射液在治疗NS中发挥着重要的作用[19]。

生长分化因子-15(GDF-15)是应激反应性细胞因子，是转化生长因子-β(TGF-β)/骨形态发生蛋白(BMP)超家族的远端成员。正常生理条件下，GDF-15主要在胎盘和前列腺中高度表达但也在心脏、胰腺、肝脏、肾脏和结肠表达[20]。多种信号转导途径可以调控内源性GDF-15的表达、分泌和储存，当病理状态下例如缺氧、炎症、急性组织损伤时[21,22]，多种细胞因子均可诱导GDF-15 mRNA的表达[23]。在一项肾功能正常的2型糖尿病患者的病例对照研究中发现，GDF-15的高表达可以预测肾脏白蛋白尿的进展[24]。在另外一项研究[25]发现，慢性肾脏病患者的GDF-15的表达与肾脏病进展(即eGFR下降30%或ESRD的发展)相关，GDF-15浓度的变化可以预测肾功能进展。

故本实验采用阿霉素肾病大鼠模型，造模成功后采用丹红注射液进行干预性治疗后发现，丹红注射液治疗后大鼠的24 h尿蛋白定量减少，血清白蛋白升高，血脂下降，肌酐、尿素氮指标明显好转，说明丹红注射液能减少阿霉素肾病大鼠的尿蛋白，这与相关的临床试验结果相吻合。此外我们还发现，与模型组比较，丹红组大鼠血清GDF-15表达明显降低，肾组织中GDF-15 mRNA和蛋白的表达减少，肾小球硬化指数减低。提示丹红注射液可以降低血浆及肾组织中的GDF-15的表达，并而降低肾小球硬化指数改善肾脏纤维化。

总之，丹红注射液静注对大鼠肾病有治疗作用，其机制可能与抑制血清GDF-15及肾组织中GDF-15 mRNA、蛋白表达有关。