不同溶剂同时蒸馏萃取艾叶挥发油的抑菌活性

葛德鹏， 李 森， 黄 凯， 管 骁

（上海理工大学 医疗器械与食品学院，上海200093）

艾草（Artemisia argyi），别名:香艾、蕲艾、艾蒿。艾草是多年生草本或略成半灌木状植物，植株有浓烈香气。 分布广，除极干旱与高寒地区外，几乎遍及全国[1]。 《本草纲目》记载“蕲艾”可入药，其植株高大，香气浓烈；叶厚纸质，被毛密而厚。 艾叶是传统的中医药原料，不仅可改善哮喘、咳嗽，亦能疏通血液[2]，而实现这些功效的物质主要是艾叶挥发油。 现已有众多科学研究表明艾叶挥发油能快速缓解哮喘等病状，并且其对金黄色葡萄球菌、痢疾芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、伤寒杆菌、大肠杆菌和假单胞菌等常见的微生物的生长具有显著的抑制作用[3]。

但艾叶挥发油的化学成分不仅十分复杂而且种类繁多，不同的提取方法会对精油的成分造成很大的差异，因此采取适当的提取条件，最大程度地获得其中的抑菌成分，是艾叶开发利用的基础。 目前，对于艾叶挥发性油的化学成分及其生物活性已有一些报道，但对提取工艺优化研究的报道较少并且局限于水蒸气蒸馏、有机溶剂渗漉法、超临界CO2等传统提取法，这些方法在提取艾叶挥发性油的过程中，存在挥发性油有效成分的破坏，有机溶剂难以分离，操作难度大成本高等问题[4-6]。 同时蒸馏萃取（SDE）在挥发油提取上具有明显的优势，集合水蒸气蒸馏及溶剂萃取的优点，提取时间短、溶剂使用少；使得样品的挥发蒸汽和溶剂反复混合，达到充分提取的效果[7-8]。 同时蒸馏萃取虽然早在1946年就被发明使用，但并没有广泛的应用到挥发油的萃取中来。 因此充分的利用这种方法，将其应用到艾叶挥发油的提取上来，必将会促进艾叶的开发应用。

作者采用二氯甲烷和正己烷2 种溶剂，通过同时蒸馏萃取获得艾叶挥发油，进而研究挥发性油对常见微生物的抑菌活性，并对挥发油采用气相色谱结合质谱（GC-MS）的方法进行成分分析，以及通过扫描电镜（SEM）来观测微生物细胞形态的变化，比较不同工艺的差异。 对比传统的水蒸气蒸馏的方法，从而挑选出艾叶挥发油的较优提取工艺，深入研究艾叶挥发油的提取工艺和挥发性油的抗菌活性，为艾叶的综合开发利用提供了实验依据。

1材料与方法

1.1 材料与设备

艾叶，购于湖北省蕲春；二氯甲烷和正己烷为分析纯，培养基及相应实验耗材均购于国药集团化学试剂有限公司。

Agilent 6890N-5973i 气相色谱—质谱联用仪（色谱柱：DB - WAX 毛细管柱，30.0 m×250 μm×0.25 μm）、Agilent 7890N - 5875i （色谱柱：HP - 5毛细管柱，30.0 m×250 μm×0.25 μm）， 美国安捷伦科技有限公司产品；同时蒸馏萃取装置，上海高信化玻仪器有限公司产品。

革兰氏阳性菌： 金黄色葡萄球菌ATCC 6538、枯草芽孢杆菌CMCC B63501、单增李斯特菌ATCC 19115；革兰氏阴性菌：大肠杆菌ATCC 12900、变形杆菌CMCC B49027、肠炎沙门氏菌ATCC 13076；真菌：黑曲霉ATCC 6633、酿酒酵母ATCC 9763，以上菌种均由上海理工大学医疗器械与食品学院提供，并于-80 ℃存放。

1.2 艾叶挥发油提取

1.2.1 水蒸气蒸馏提取 依据权美平的研究[9]，称取100 g 艾叶原料，放入2000 mL 圆底烧瓶中，加入1500 mL 去离子水，加热煮沸，3 h 后，收集提取物，计算提取率。 低温密封保存，留用。

其中m 表示质量。

1.2.2 同时蒸馏萃取 同时蒸馏萃取使用图1 所示装置，组装好同时蒸馏萃取装置，参照夏雪娟[10]的方法，称取100 g 艾叶原料，放入2000 mL 圆底烧瓶中，加入1500 mL 的去离子水；量取25 mL 二氯甲烷加入100 mL 圆底烧瓶中；开始加热。 萃取3 h后，收集提取物，使用旋转蒸发仪浓缩后，计算提取率，低温密封保存，留用。

将二氯甲烷换为正己烷，重复上述操作。 萃取3 h 后，收集提取物，使用旋转蒸发仪浓缩后，计算提取率，低温密封保存，留用。

1.3 抑菌活性

挥发油的成分决定其抑菌活性，而不同提取工艺会对挥发油成分产生很大的影响，因此对以上获得的3 种挥发油进行目标菌种的抑菌活性研究，分析提取工艺对抑菌活性的影响。

1.3.1 抑菌圈试验 吸取100 μL 活化后的金黄色葡萄球菌菌液均匀涂布到营养琼脂固体培养基上，将培养基等分成4 个区域，在各个区域中间放置准备好的直径6 mm 的滤纸片， 移液枪吸取10 μL 水蒸气蒸馏提取物滴至滤纸片中间，迅速盖上培养皿盖，用密封膜密封，放置培养箱中，37 ℃培养24 h，2种溶剂体系下的同时蒸馏萃取物重复以上步骤，观察结果。 其它菌种选择相应的培养基和培养条件，重复以上步骤，获得抑菌圈实验结果[11]。

图1 同时蒸馏萃取装置Fig. 1 Schematic diagram of the simultaneous distillation and extraction experimental apparatus.

1.3.2 最低抑菌浓度 将3 种挥发油提取物用体积分数50%的乙醇由50 μL/mL 起，二倍稀释10 个浓度梯度，至0.05 μL/mL；吸取100 μL 活化后金黄色葡萄球菌菌液以及等量的相应梯度浓度的提取物，混合均匀后，均匀涂布到营养琼脂培养基上，迅速盖上培养皿盖，用密封膜密封，放置培养箱中，37 ℃培养24 h，观察结果。其它菌种选择相应的培养基和培养条件，重复以上步骤，获得抑菌圈实验结果[12]。

1.4 GC-MS 成分分析

色谱柱型号：HP-5 MS 30 m×0.25 mm×0.25 μm，柱温程序： 起始温度50 ℃保持1 min， 以4 ℃/min速度升温至200 ℃，保持1 min，再以20 ℃/min 的速度升温至280 ℃保持至完成分析； 进样口温度250 ℃；载气为He，流速为1 mL/min；进样量1 μL，分流比为40∶1；70 eV 电子轰击离子源，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，接口温度280 ℃，溶剂延迟5 min，质量范围10～550 amu。

1.5 扫描电镜SEM 微生物形态变化观察

收集以上最低抑菌浓度测定实验后的样品，在3000 r/min 的条件下离心15 min，收集沉淀，加入pH 7.4 的PBS 洗涤2 次后，再次离心，再加入体积分数2.5%的戊二醛（pH7.4 的PBS 稀释），在4 ℃下固定过夜（16 h），再次使用pH 7.4 的PBS 冲洗，使用乙醇梯度脱水，冷冻干燥，喷重金属进行SEM 观察并拍摄细胞形态[13-14]。

2结果与讨论

2.13 种工艺提取艾叶挥发油结果分析

按照选择的提取方法以及设置的提取条件，获得的提取物通过脱水后测定得率。 结果如表1 显示，3 种提取工艺均可获得艾叶挥发油，但传统的水蒸气蒸馏工艺需要提取4 h 才能最大限度的将挥发油提取完全，相较于同时蒸馏萃取工艺来说，多用了1 h；而在得率上，同时蒸馏萃取（二氯甲烷）得率为1.5%，同时蒸馏萃取（正己烷）得率为1.2%，2 种工艺的提取率相似， 且均高于水蒸气蒸馏的0.5%；在颜色上，水蒸气蒸馏萃取得物颜色更深，这可能因为长时间的高温提取，使得挥发油得物的成分发生改变，分解或合成一些深色的成分；而同时蒸馏萃取工艺的提取时间较短，因而这种化学成分的变化几率较低，比水蒸气蒸馏萃取得物的颜色浅[15]。由以上结果，同时蒸馏萃取工艺相对于传统的艾叶挥发油提取方法水蒸气蒸馏萃取在提取时间和提取率上更具有优势。

表13 种工艺提取艾叶挥发油的提取结果Table 1 Yield of Artemisia argyi essential oils obtained by three different extraction methods

2.2 艾叶挥发油的抑菌活性结果分析

不同的提取工艺不仅对艾叶挥发油的提取率以及颜色和气味等产生影响，对其生物活性有很大的影响。 抑菌活性是艾叶挥发油的一种重要的生物活性，因此这里对3 种工艺提取的艾叶挥发油的抑菌活性进行了研究。 包括抑菌圈和最低抑菌浓度试验，结果分别如图2 和图3 所示。

由图2 可知，3 种工艺提取的艾叶挥发油都具有广谱的抑菌活性，水蒸气蒸馏萃取得物的抑菌圈结果是0.935～1.823 cm，但对革兰氏阴性菌（大肠杆菌、变形杆菌、沙门氏菌）以及单增李斯特菌和真菌的结果主要集中在1 cm；SDE（正己烷）得物的范围在1.123～1.580 cm， 且对革兰氏阳性菌和阴性菌的结果主要集中在1.5 cm；SDE（二氯甲烷）得物的范围在0.728～1.528 cm， 但对多数受试菌的抑菌圈结果均在1 cm 以下。最低抑菌浓度（MIC）的结果又印证了抑菌圈结果，水蒸气蒸馏萃取得物对革兰氏阳性菌以及真菌的MIC 结果均为6.25 μL/mL，但对变形杆菌的MIC 达到25 μL/mL；SDE（正己烷）对革兰氏阴性菌及真菌的MIC 结果均为6.25 μL/mL，对其它菌种的MIC 结果最高为12.5 μL/mL；SDE （二氯甲烷）对所有受试菌种的MIC 结果均大于12.5 μL/mL，甚至对沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、单增李斯特菌、黑曲霉的MIC 结果达到了25 μL/mL。

图23 种工艺提取艾叶挥发油的抑菌圈试验结果 （抑菌圈直径）Fig. 2 Inhibition zone of Artemisia argyi essential oils against various microorganisms

图33 种工艺提取艾叶挥发油的最低抑菌浓度（MIC）Fig. 3 Minimum inhibitory concentration （MIC） of Artemisia argyi essential oils against various microorganisms

综合以上抑菌圈和最低抑菌浓度的结果，从受试菌来说，实验中的革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、单增李斯特菌）相对于革兰氏阴性菌和真菌对艾叶挥发油更敏感， 其抑菌圈更大，最低抑菌浓度更小；从提取工艺来说，SDE（正己烷）得到的挥发油的抑菌活性比其余2 种工艺更具有广谱抑菌性，且抑菌圈更大，最低抑菌浓度更低，更具有优势。 而SDE（二氯甲烷）的挥发油得物的抑菌活性低于另外2 种工艺的挥发油得物。

由此可见，不同提取方法获得的艾叶挥发油的抑菌活性存在很大的差异，甚至同一种方法，不同溶剂下，其抑菌活性的差异也很大。 但得到这样的结果，可能是因为由于萃取时间长，水蒸气蒸馏萃取获得的挥发油的成分比SDE 的种类多，抑菌活性受多种成分协同的作用可能性大，因此水蒸气蒸馏萃取得物对受试菌也有一定的抑制活性。 SDE 使用了有机溶剂，可能将挥发油中有抑菌活性的主要成分聚集，因此SDE（正己烷）的抑菌活性超过了水蒸气蒸馏萃取的得物；但不同溶剂存在极性等性质的差异，造成得到的艾叶挥发油的成分种类，或者含量不同[16]，因此SDE（二氯甲烷）得物的抑菌活性比其余两者较弱。

2.3 GC-MS 成分分析结果

不同的提取工艺会对挥发油的成分产生影响，因此本研究进一步对3 种工艺提取获得的艾叶挥发油进行GC-MS 成分分析，结果如表2 所示。 水蒸气蒸馏萃取得物有66 种成分，SDE（二氯甲烷）得物有37 种成分，SDE（正己烷）得物有10 种成分；其中α-侧柏酮、右旋樟脑、β-石竹烯、龙脑、氧化石竹烯、甲乙烯基萘酚等是3 种工艺得物的公共主要成分，这6 种成分分别占水蒸气蒸馏得物、SDE （二氯甲烷）、SDE （正己烷） 总成分的44.23%、52.42%、92.95%。 由此可见，不同提取方法之间在得物的成分种类数量上存在很大差异，不同溶剂下同时蒸馏萃取得物的成分种类也有很大差异。 造成这种结果的原因可能是因为提取时间的长短造成得物成分的差异，而溶剂的极性等性质的差异也是得物成分差异的主要原因[17-18]。

综合以上结果，不同工艺的艾叶挥发油得物在成分的种类和含量上确实有很大差异，因此这种结果亦能解释抑菌活性的差异。 SDE（正己烷）的得物成分种类数量远远不如其余2 种工艺的得物，但其3 种工艺的得物的公共成分含量最高， 这些成分可能是艾叶挥发油抑菌活性的有效成分， 因此SDE（正己烷）的抑菌效果优于其余2 种工艺的得物。

表23 种工艺提取艾叶挥发油的GC-MS 分析结果Table 2 Chemical composition (in percent) of Artemisia argyi essential oils obtained by three different methods

续表2

2.4 扫描电镜结果分析

通过抑菌活性的结果可知革兰氏阳性菌对艾叶挥发油更具有敏感性，而金黄色葡萄球菌的敏感程度尤为突出，为进一步验证3 种工艺得物的抑菌活性的差异， 以及深入探索艾叶挥发油的抑菌机制，本研究进而以处理后的金黄色葡萄球菌为目标菌种， 采用扫描电镜的方法观察细胞的形态变化，其结果如图4 所示。

图43 种工艺提取艾叶挥发油的SEM 分析结果Fig. 4 SEM results of Artemisia argyi essential oils obtained by three different methods

从图中可以看出细胞排列紧密，呈现出典型的葡萄球状，而经过3 种工艺提取得到的艾叶挥发油处理金黄色葡萄球菌后的细胞形态 （图4 中（a）、（b）、（c））与未使用艾叶挥发油处理的金黄色葡萄球菌的细胞形态（图4 中（d））存在明显差异。 （d）中因为培养时间的延长和后期的处理，出现了微弱的细胞破碎[19-20]，如（d）中圆圈所示；（a）、（b）、（c）中均出现了明显的细胞形态变化及细胞破碎，且程度都强于未由艾叶挥发油处理的（d）；（a）、（b）、（c）中的细胞形态变化进一步证明艾叶挥发油具有明显的抑菌活性，而细胞的破碎和变形，说明艾叶挥发油的抑菌活性可能是因为对微生物的细胞壁结构的破坏完成的。

3结 语

作者将同时蒸馏萃取作为艾叶挥发油的提取方法，使用同时蒸馏萃取常用的二氯甲烷作为提取溶剂， 引用未曾广泛使用的正己烷作为第2 种溶剂， 对比传统的艾叶挥发油的水蒸气蒸馏萃取法，系统的分析了提取率和工艺用时， 得知SDE 用时少，提取率高；通过抑菌活性的研究，得知SDE（正己烷）的抑菌活性强于其它2 种工艺；而对得物成分的GC-MS 分析结果可知SDE（正己烷）虽然成分种类最少，但主要的成分含量很多，因此正己烷有望成为同时蒸馏萃取方法的重要溶剂；扫描电镜的分析结果进一步揭示艾叶挥发油的显著抑菌效果，并表明艾叶挥发油会作用于微生物细胞壁结构，从而达到抑菌效果。 但深入的抑菌机理，主要的抑菌活性成分还尚待在以后的研究中继续探索。