前导肽对Aspergillus pseudoglaucus 酸性蛋白酶App 表达及功能的影响

2020-05-19刘海燕张荣珍李利宏周丽仙

食品与生物技术学报 2020年3期

刘海燕，张荣珍，李利宏，周丽仙，徐岩

（江南大学生物工程学院，江苏无锡214122）

蛋白酶（Protease）是一类能够催化蛋白水解为小分子的多肽和氨基酸的水解酶类，其在动植物及微生物中广泛存在[1-2]。根据不同分类标准，蛋白酶有多种分类，其中根据其最适作用pH 的不同可将其分为碱性蛋白酶、中性蛋白质酶和酸性蛋白质酶。酸性蛋白酶是能在酸性环境下水解蛋白的蛋白酶类，其最适作用pH 在2.0～5.0 之间。目前酸性蛋白酶已广泛应用于食品[3]、酿造[4]、皮革与皮毛[5]、医药[6]、饮料[7]等各个领域。 Sun 等[8]将来源于RhizomucormieheiCAU432 的一种酸性蛋白酶（RmproA）作为嫩肉剂应用于猪肉，结果显示经过RmproA 处理后的猪肉比木瓜蛋白酶处理后的猪肉显示更低的剪切力。 Steven 等[9]发现来自Botrytis cinerea的酸性蛋白酶BcAP8 能够有效除去白酒酿造过程中产生的蛋白浑浊。 Swarna 等[10]将酸性蛋白酶应用于皮革染色工艺并进行对照实验，结果显示与对照相比，经过酸性蛋白酶处理后的皮革表现出更加丰富的颜色和色调。目前，国外对蛋白酶的研究主要集中在新品种的发掘、理想产生菌的选育以及酶学性质的改造等。而我国目前在这方面的研究尚存在许多不足，如微生物资源开发不足、酶制剂品种较为单一等[11]。因此进一步探索开发和研究新型酸性蛋白酶显得很有必要。

研究表明，许多酶在细胞中产生时首先会以酶原形式出现，酶原主要包括3 部分：信号肽、前导肽和成熟肽[12]，其中前导肽对酸性蛋白酶的表达及正确折叠有着重要的作用。前导肽能够作为分子内伴侣[13]或帮助蛋白质正确折叠[14-15]；与此同时，研究证明前导肽对蛋白质的功能活性也具有调节作用[12]。Wang 等[16]克隆了来源于Rhizomumor miehei的脂肪酶并在大肠杆菌中进行表达，发现如果不添加前导肽，目的蛋白则无法正常表达。Cai 等[17]发现若将来源于Thermomyces lanuginosus的脂肪酶的前导肽去除后于Pichia pastoris中异源表达，其酶活低于带有前导肽的重组脂肪酶。目前关于酸性蛋白酶的前导肽对酶蛋白在大肠杆菌中表达和功能影响的研究很少。

本研究对来源于Aspergillus pseudoglaucus的酸性蛋白酶App 进行了重组表达，考察了包含其自身前导肽在内的共5 种前导肽对酶蛋白的表达及酶学性质的影响。研究了重组酶的最适酶活条件，分析了不同前导肽对App 蛋白的二级结构的影响，测定了App 对乳蛋白的水解酶活，为App 的进一步研究及工业应用提供了良好的研究基础。

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种与质粒本研究中使用的菌株和质粒如表1 所示。

表1 实验菌株和质粒Table 1 Strains and plasmids in this work

续表1

表2 实验引物Table 2 Primers in this work

续表2

1.1.3 基因 4 种酸性蛋白酶的基因分别是：来自Candida tropicalis的candidapepsin 基因，来自Saccharomyces cerevisiaeS288c 的proteinase A 基因，来自Rhizomucor miehei的proteinase 的基因和来自Candida albicans的aspartic proteinase 2 的基因，所有基因经密码子优化后由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.4 主要试剂 PrimeSTAR HS（Premix）、T4 DNA Ligase、DNA Marker、限制性内切酶、IPTG，购于TaKaRa 生物有限公司；质粒提取、凝胶回收和DNA回收试剂盒，购于OMEGA BIO-TEK。引物由上海生工生物工程有限公司合成。其余试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 菌体培养马铃薯培养基（g/L）：马铃薯200，葡萄糖20；pH 7.0；添加1.5 g/dL 琼脂粉即为马铃薯固体培养基。将A. pseudoglaucus菌种分别接种于装有5 mL 马铃薯液体培养基的试管中，28 ℃、200 r/min 振荡培养48 h。

1.2.2 基因组DNA 将菌体于10000 r/min 离心2 min 并收集细胞，用1 mL 超纯水离心洗涤2 次（10000 r/min，2 min）。依次加入0.2 mL 无菌水、0.3 g 玻璃珠（0.4 mm）和0.3 mL 的PC（苯酚∶氯仿体积比为1∶1 的混合物）混匀，使用细胞破碎仪破碎细胞30 s 后加入0.6 mL 超纯水，颠倒混匀。 10000 r/min离心10 min。取上清液300～400 μL 加入2 倍体积冰乙醇，4 ℃静置4 h 后10000 r/min 离心15 min。弃上清液，真空干燥至无乙醇，加入50 μL 无菌水溶解基因组。

1.2.3ProApp和App基因的获得以A. pseudoglaucus基因组为模板，通过DNAMAN 软件设计引物如表2中所示（下划线为限制性内切酶识别位点）。以A. pseudoglaucus基因组为模板，PCR 扩增App基因，条件为：98 ℃30 s；98 ℃10 s，68.5 ℃30 s，72 ℃60 s，30 次循环；72 ℃10 min。以A. pseudoglaucus基因组为模板，PCR 扩增proApp基因，条件为：98 ℃30 s；98 ℃10 s，68.5 ℃30 s，72 ℃69 s，30 次循环；72 ℃10 min。 PCR 产物经柱纯化后，进行加A 处理后连接至pMD19-T 上，连接产物转化至E.coliJM109感受态细胞，涂布于LB 固体培养基（含100 μg/mL氨苄青霉素），获得阳性克隆后提取质粒，使用限制性内切酶EcoR I 和XhoI 分别对质粒T-App和质粒T-proApp进行双酶切验证后由上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.2.4 不同前导肽App 基因的获得利用重叠延伸PCR 法，第1 步：以合成的4 种酸性蛋白酶基因为模板，分别以表2 中相对应每组中f1和r1为引物，PCR 扩增前导肽基因，分别是来自C.tropicalis的candidapepsin 的前导肽基因CP，来自S. cerevisiaeS288c 的proteinase A 的前导肽基因PP，来自R.miehei的proteinase 的前导肽基因RP和来自C.albicans的aspartic proteinase 2 的前导肽基因SP，条件为：98 ℃30 s；98 ℃10 s，Tm30 s，72 ℃10 s，30 次循环；72 ℃10 min。其中变性温度Tm按CP、PP、RP、SP的顺序依次为55、55、55.8、52.8 ℃。以proApp基因为模板，分别以表2 中相对应每组中f2和R2为引物，PCR 扩增App基因，条件为：98 ℃30 s；98 ℃10 s，68 ℃30 s，72 ℃60 s，30 次循环；72 ℃10 min。将PCR 扩增产物进行1 g/dL 琼脂糖凝胶电泳，胶回收PCR 产物。第2 步：将第一步回收获得的前导肽基因和与之对应的App基因互为模板和引物，补齐其他扩增反应试剂，获得带有不同来源的前导肽App基因的PCR 产物（CP-App、PP-App、RP-App、SP-App），条件为98 ℃30 s；98 ℃10 s，66.9 ℃30 s，72 ℃60 s，10 次循环；72 ℃10 min。PCR 结束后分别在管中加入每组相对应的引物F1和R2，继续进行PCR 扩增，条件为98 ℃30 s；98 ℃10 s，66.9 ℃30 s，72 ℃70 s，30 次循环；72 ℃10 min。PCR 产物经柱纯化后，进行加A 处理后连接至pMD19-T 上，连接产物转化至E. coliJM109 感受态细胞，涂布于LB 固体培养基（含100 μg/mL 氨苄青霉素），获得阳性克隆后提取质粒，使用限制性内切酶BamH I 和XhoI 分别对质粒T-CP-App、质粒T-PP-App、质粒T-RP-App和质粒T-SP-App进行双酶切验证后由上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.2.5 表达载体的构建使用限制性内切酶EcoR I和XhoI 分别对载体pET-28a、质粒T-App、质粒T-proApp进行双酶切；使用限制性内切酶BamH I和XhoI 分别对载体pET-28a、质粒T-CP-App、质粒T-PP-App、质粒T-RP-App和质粒T-SP-App进行双酶切。所有酶切产物回收DNA 片段通过粘性末端连接获得重组表达质粒pET-App、pETproApp、pET-CP-App、pET-PP-App、pET-RP-App和pET-SP-App。连接产物转化至E. coliJM109 感受态细胞，涂布于LB 固体培养基（含50 μg/mL 卡那霉素），获得阳性克隆后提取质粒，使用限制性内切酶分别对重组表达质粒进行双酶切验证后由上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.2.6 重组菌株的构建将重组表达质粒转化至感受态细胞E. coliBL21 （DE3）菌株，从卡那霉素抗性平板上筛选出重组菌株E. coliBL21/pETApp、E. coliBL21/pET-proApp、E. coliBL21/pETCP-App、E. coliBL21/pET-PP-App、E. coliBL21/pET-RP-App和E. coliBL21/pET-SP-App的阳性克隆。

回顾性选取2017年4月-2018年4月在我院行血液透析治疗64例患者的临床资料,其中男34例,女30例,年龄16-80岁,平均年龄(53.7±6.8)岁,平均透析病程(3.1±1.7)年,按疾病分类:急性肾衰竭患者26例,慢性肾衰竭38例。

1.2.7 蛋白纯化从平板上挑取重组菌E. coliBL21/pET-App、E. coliBL21/pET-proApp、E. coliBL21/pET-CP-App、E. coliBL21/pET-PP-App、E.coliBL21/pET-RP-App和E. coliBL21/pET-SPApp的单菌落分别接种于含有50 μg/mL 卡那霉素的200 mL LB 液体培养基中，当菌体培养的OD600值达到0.6～0.8 时，加入终浓度为0.1 mmol/L 的诱导剂IPTG，20 ℃诱导表达10 h。将诱导表达后的菌液离心，收集菌体，使用生理盐水洗涤3 次后重悬于20 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0），超声破碎。12000r/min，4 ℃离心收集上清液，经0.22 μm 滤膜过滤后的滤液即为粗酶液。利用镍离子亲和层析柱。

1.2.8 酶活力测定蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸，酪氨酸在碱性条件下使福林酚试剂还原生成钼蓝与钨蓝，在680 nm 处有最大吸光度，其吸光值与酪氨酸含量成正比。因此可通过测定反应过程中680 nm 处吸光度的变化来衡量蛋白酶的活力。酶活测定方法参照国标GB/T 23527-2009，每个实验重复3 次取平均值。蛋白质含量采用Bradford 法测定[18]，以BSA 为标准蛋白质。定义1 个酶活单位（U）为每分钟催化产生1 μg 酪氨酸所需的酶量。

1.2.9 乳蛋白水解活性测定以乳蛋白为底物测定蛋白酶对其水解活力。每个实验重复3 次取平均值。

1.2.10 圆二色谱分析以10 mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH 6.0）为溶剂将纯化蛋白稀释至0.1 mg/mL，使用Jasco J720 光谱仪在25 ℃条件下进行二级结构的测定，光谱值范围为190～250 nm，扫描速度50 nm/min，带宽2 nm，反应时间1 s，读数30 次，取信号平均值并基线校正，将所测定的CD 值转换成摩尔椭圆度（molar ellipticity） θ （deg×cm2×dmol-1），用计算机专用软件（J-700 for Windows Secondary Structure Estimaton, Version 1.10.00）分析各蛋白质二级结构组成[19]。

2结果与讨论

2.1 重组质粒pET-App 和pET-proApp 的构建

以A.pseudoglaucus基因组为模板，分别以App_F 和App_R、proApp_F 和proApp_R 为引物，进行PCR 扩增，获得目的基因App和proApp，经过1 g/dL 琼脂糖凝胶电泳分析其条带大小约为为1.0 kb和1.1 kb。将App和proApp基因片段连入pMD19-T，经EcoR I 和XhoI 双酶切后连入pET-28a 载体。2 种重组质粒均经双酶切鉴定后转入E. coliJM109感受态细胞中，挑取阳性克隆提取质粒并送去测序，测序结果显示2 种基因均已克隆到相应表达载体上，获得重组质粒pET-App和pET-proApp。测序正确的重组表达质粒转入E. coliBL21 （DE3）感受态细胞获得重组表达菌株。

2.2 不同前导肽App 重组质粒的构建

分别以proApp基因和合成的4 种酸性蛋白酶基因为模板，进行重叠延伸PCR，获得目的基因CP-App、PP-App、RP-App和SP-App，经1 g/dL 琼脂糖凝胶电泳其条带大小为1.1 kb 左右。将基因片断连入pMD19-T，经BamH I 和XhoI 双酶切后连入pET-28a 载体。 4 种重组质粒转入E. coliJM109 感受态细胞中，挑取阳性克隆提取质粒，经双酶切鉴定后送去测序，测序结果显示2 种基因均已克隆到相应表达载体上，获得重组质粒pET-CP-App、pET-PP-App、pET-RP-App和pET-SP-App。测序正确的重组表达质粒转入E. coliBL21 （DE3）感受态细胞获得重组表达菌株。

2.3 重组蛋白酶的表达及纯化

挑取E. coliBL21/pET-App、E. coliBL21/pETproApp、E. coliBL21/pET-CP-App、E. coliBL21/pET-PP-App、E. coliBL21/pET-RP-App和E. coliBL21/pET-SP-App的单菌落至含卡那霉素抗性的LB 液体培养基中培养，分别在20、25 ℃和30 ℃条件下，经IPTG 诱导后收集菌体，洗涤后重悬于Tris-HCl 缓冲液中，超声破碎、离心、过膜得到粗酶液。取上清液和沉淀分别进行SDS-PAGE 蛋白质电泳，如图1 所示。结果显示E. coliBL21/pET-App在3 种温度下的破碎上清液和沉淀均未见目的蛋白质条带，其他蛋白酶重组菌株均在20 ℃条件下实现可溶性表达，破碎上清液中存在目的蛋白条带。由此说明前导肽有助于App 蛋白酶在大肠杆菌中表达。然后将粗酶液使用Ni 柱进行分离纯化，经SDSPAGE 电泳分析，重组蛋白纯化后获得目的蛋白条带均一，约为5.5×104，与理论相对分子质量大小一致（图2）。纯化蛋白于-80 ℃保存，用于后续研究。

图1 重组蛋白酶的表达Fig. 1 Expression of E. coli BL21/pET-App, E. coli BL21/pET-proApp, E. coli BL21/pET-CP-App, E. coli BL21/pET-PP-App, E. coli BL21/pET-RP-App and E.coli BL21/pET-SP-App

图2 重组蛋白酶的纯化Fig. 2 Purification of the recombinant proteases

2.4 重组蛋白酶酶活的测定

在pH 3.0 条件下，以酪蛋白为底物，在不同温度下测定了重组酶的酶活。结果显示除了proApp具有较高的酶活外，其他重组蛋白酶均未检测到酶活。在55 ℃时proApp 的酶活力达到最高，为826 U/mg（图3（a））。在55 ℃条件下，不同pH 时，proApp的蛋白酶活进行了测定，但由于酪蛋白的等电点在4.5 左右，在pH 3.5～5.5 范围内酪蛋白不溶或溶解度很小，因此测定最适pH 时pH 的范围在2.2～3.2。结果显示除了proApp 具有酶活外，其他重组蛋白酶均无酶活。当pH 为2.8 时proApp 达到最大酶活，为903 U/mg（图3（b））。上述结果表明不同来源的前导肽虽然能够使App 在大肠杆菌中成功可溶性表达，但不能促使蛋白质正确折叠，导致蛋白酶没有酶活。为了探索不同前导肽对App 酶活影响的原因，后续试验对所有重组蛋白酶二级结构进行了分析。

图3 不同温度下和不同pH 下proApp 的酶活Fig. 3 Protease activities of proApp at different temperature and different pH

2.5 重组蛋白酶二级结构分析

从图4 可以看出，随着波长的变化，CP-App、PP-App、RP-App、SP-App 与proApp 的摩尔椭圆度显示出完全不同的变化趋势，说明proApp 的二级结构与其他4 种具有不同前导肽蛋白酶的二级结构存在很大差异，CP、PP、RP 和SP 这4 个前导肽改变了App 蛋白的二级结构，使其未能正确折叠。二级结构结果证实了4 种其他来源的前导肽虽然能够使App 蛋白在大肠杆菌中可溶性表达，但无法促使其正确折叠，因而表现为没有酶活。

图4 proApp、CP-App、PP-App、RP-App 和SP-App 的圆二色谱分析Fig. 4 Circular dichroism analysis of secondary structures for proApp、CP-App、PP-App、RP-App and SPApp

2.6 ProApp 乳蛋白水解活性的测定

以乳蛋白为底物，检测不同条件下proApp 对乳蛋白的水解活力，结果如图5 所示。在pH 3.0 条件下，在不同温度条件下对proApp 水解乳蛋白活性的活性进行了检测。可以发现在55 ℃条件下，proApp 对乳蛋白的水解活性达到最大为160 U/mg。在55 ℃条件下，在不同pH 条件下，对proApp 水解乳蛋白的活性进行了检测。可以发现在pH 2.2 时，proApp 对乳蛋白的水解活性达到最大值，为252 U/mg。以上结果表明proApp 对乳蛋白具有较好的水解活力。

3结语

酸性蛋白酶是能够在酸性环境下具有水解活性的蛋白酶类，近年来随着人们对其研究越来越深入，其应用也越来越广泛[20]。近年来国外对蛋白酶的研究主要在新品种的发掘、理想蛋白酶产生菌的选育和酶的改造以适应工业需求。而我国目前在这方面的研究尚存在许多问题如微生物资源开发不足、酶制剂品种较为单一等。因此进一步探索开发和研究新型酸性蛋白酶显得很有必要。本研究从基因工程和蛋白质工程角度出发，对来源于A. pseudoglaucus的酸性蛋白酶App 进行了重组表达并对其酶学性质进行了分析。通常情况下，酸性蛋白酶在细胞中首先是以酶原形式出现的，酶原主要包括3 部分：信号肽、前导肽和成熟肽。其中前导肽对蛋白质的表达和折叠有着重要意义[21-22]。此外也有研究表明前导肽对蛋白质的功能活性具有修饰和调节作用。我们分别构建了2 种重组App 蛋白酶表达菌株即加前导肽的重组菌株E. coli BL21/pET-proApp 和不加前导肽的重组菌株E. coli BL21/pET-App。通过诱导表达，我们发现若不加前导肽App 不能在大肠杆菌中表达。为了进一步探索前导肽对App 的表达和酶功能的影响，选取了4 个不同来源的前导肽，通过重叠延伸PCR 技术将前导肽基因加到App基因5′端，构建了4 株重组酸性蛋白酶表达菌株E.coli BL21/pET-CP-App、E.coli BL21/pET-PP-App、E. coliBL21/pET-RP-App 和E. coliBL21/pET-SP-App。分别进行诱导表达并进行SDS-PAGE 蛋白质电泳分析，发现4 种重组蛋白酶均成功可溶性表达。然而对5 种具有不同前导肽的App 蛋白酶的酶活检测结果显示，除proApp具有酶活外，最大酶活为903 U/mg，其他含有其他来源前导肽的4 种重组蛋白酶均无酶活。对5 种含有前导肽的蛋白酶的二级结构进行了检测，发现CP-App、PP-App、RP-App和SP-App 的二级结构与proApp 的二级结构有很大差异，说明前导肽可以改变蛋白质的折叠，从而影响蛋白质的功能。最后我们对proApp 的乳蛋白水解活性进行了研究，发现proApp 对乳蛋白在酸性条件下具有较好的水解能力，水解活性最大可达252 U/mg。本研究探索了前导肽对App 重组酶的表达和酶活的影响，表明前导肽的种类对App 的表达和结构具有决定性的影响，为进一步探索App 对蛋白质的水解工业应用提供了较好的研究基础。