玉米赤霉烯酮对小鼠血清生化指标及肝脏、肾脏组织结构的影响

王丙雷，崔亚利*，王 飞，周令强，陈宝江，崔 嘉

(1.河北农业大学 动物医学院，河北 保定 071000；2.河北农业大学 动物科技学院，河北 保定 071000)

动物饲料中的霉菌毒素污染在世界范围内普遍存在，霉菌毒素中毒引起机体多种功能紊乱，严重损害动物健康。玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEA)是一种具有类雌激素样作用的非固醇类真菌毒素，在饲料和饲料原料中检出率较高，是对动物和人危害较大的主要霉菌毒素之一。众所周知，ZEA可诱导细胞毒性和氧化损伤，在体内经过肠肝循环后通过肾脏排出体外，故ZEA除具有生殖系统毒性[1]外，还主要表现在肝脏毒性[2-3]和肾脏毒性[4-5]。动物试验已经证明，ZEA是一种内分泌干扰物，通过影响脑垂体和性腺的功能破坏激素平衡[6]，发挥雌激素样作用引起动物生殖功能的损害，而且ZEA对机体产生的影响与动物生殖状态(青春期前、发情周期 、妊娠期等)、摄入剂量和摄入时间等因素有关[7]。此外，ZEA通过与细胞质中的雌激素受体结合，导致脂质过氧化和一系列细胞毒性作用，改变血清酶学和活性氧水平(ROS)。研究表明，ZEA对小鼠的血液、肾脏和肝脏具有高度毒性，可以改变小鼠的酶和血液学参数，并且可以诱导更高水平的氧化应激[8-9]。

玉米赤霉烯酮由于摄入剂量、靶细胞类型的不同具有不同的毒性机制。高剂量ZEA通过诱导细胞周期阻滞、氧化应激、DNA损伤、线粒体损伤和凋亡引起细胞死亡[10]。低剂量的ZEA发挥雌激素样作用和致癌特性，刺激细胞的增殖。当动物摄入NOAEL (no observable adverse effect level) 剂量ZEA时，并不都表现临床症状但是可引起细胞和组织水平的机能障碍。在调查中，饲料中霉菌毒素浓度通常较低，急性毒性很少发生，因此研究长期接触低浓度霉菌毒素对动物和人类健康的影响更具有重要意义。本试验拟在小鼠日粮中添加不同较低剂量的ZEA，研究其对肝脏、肾脏组织结构及血液中代谢产物、抗氧化能力的影响，探讨机体对低剂量ZEA较为敏感的变化。

1 材料与方法

1.1 主要试剂ZEA纯品由加拿大Triplebond公司生产，纯度保证值为98%。

1.2 试验动物与饲养管理购入体质量18～22 g的4周龄SPF级昆明雌性小鼠80只，随机分为4组，每组20只。对照组饲喂基础日粮(ZEA水平实测值0.4 mg/kg，GB≤0.5 mg/kg)，试验1、2、3组在基础日粮中分别添加50，100，150 mg/kg ZEA (ZEA水平实测值分别48.6，97.4，146.3 mg/kg)，预试期7 d，试验期20 d。小鼠自由采食和饮水，每2 d 更换1次垫料。饲养温度控制在18～22℃，湿度50%～60%。

1.3 添加ZEA日粮的制备按照试验设计，在小鼠基础日粮粉状料中加入相应比例ZEA，加水搅拌。方法如下：先用无水乙醇溶解(1 g/L)纯结晶状ZEA，然后喷洒在少量基础日粮中，处理的饲料室温过夜使溶剂蒸发，最后混入基础料达到设计的浓度(mg/kg饲料)。使用塑料漏斗制成柱状颗粒料，50℃ 5～6 h烘干，采用罗马公司玉米赤霉烯酮试剂盒检测日粮ZEA含量。

1.4 样品采集饲喂20 d后，通过观察小鼠外阴及阴道涂片，在3 d内挑选出发情前期、发情期小鼠各10只。对小鼠进行眼部采血，静置2 h，待析出血清后离心，3 500 r/min离心10 min，分离血清-20℃保存，以备测定血清中代谢产物和抗氧化指标。采血结束后颈椎脱臼法处死小鼠，取肝脏、肾脏，波恩液固定，以备制作石蜡切片。

1.5 血清代谢产物测定血清中总蛋白(TP)、胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和尿素氮(BUN)浓度均采用高密彩虹GF-D2000型半自动生化分析仪测定，按照试剂盒操作步骤进行测定。TP试剂盒(B1010)、CHOL试剂盒(B1002)、TG试剂盒(B1001)、HDL试剂盒(B1003)、LDL试剂盒(B1004)和BUN试剂盒(B1017)均购于北京北检新创源生物技术有限公司。

1.6 血清抗氧化指标测定血清中总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)活性(含量)均采用高密彩虹722分光光度计测定，按照试剂盒说明书进行测定。T-AOC试剂盒(A015-1)、GSH-Px试剂盒(A005)、SOD试剂盒(A001-1)MDA试剂盒(A003-1)均购于南京建成生物工程研究所。

1.7 石蜡切片的制备波恩液固定的肝、肾组织，常规制备石蜡切片，HE染色，显微镜观察。

1.8 数据处理与分析本试验数据采用由IBM公司推出的SPSS 21.0统计软件进行描述性统计与单因素方差分析，结果采用“平均值±标准差”来表示。

2 结果

2.1 ZEA对小鼠血清代谢产物的影响饲料中添加不同水平ZEA对小鼠血清代谢产物的影响见表1。与对照组相比，发情前期试验1、2、3组尿素氮的水平极显著增加(P<0.01)；试验1组总蛋白水平极显著升高(P<0.01)，试验2 组和3组总蛋白水平没有显著变化(P>0.05)。发情期小鼠，试验1组与对照组比较尿素氮的水平没有显著变化(P>0.05)，试验2、3组则极显著升高(P<0.01)；试验1、2、3组总蛋白水平均极显著升高(P<0.01)。

发情前期，3个试验组总胆固醇水平与低密度脂蛋白水平极显著高于对照组(P<0.01)；试验1组和2组高密度脂蛋白水平极显著高于对照组(P<0.01)，试验3组的高密度脂蛋白水平没有显著变化(P>0.05)；3个试验组甘油三酯的水平与对照组比较没有显著变化(P>0.05)。 发情期，试验1组总胆固醇水平极显著高于对照组(P<0.01)，试验2组和3组没有显著变化(P>0.05)；3个试验组的高密度脂蛋白水平均极显著低于对照组(P<0.01)，低密度脂蛋白水平均极显著高于对照组(P<0.01)；试验1组和2组甘油三酯的水平极显著升高(P<0.01)，试验3组没有显著变化(P>0.05)。

表1 不同添加水平ZEA对小鼠血清代谢产物的影响

注：1.同行数据间肩标相同或没有标注表示为差异不显著(P>0.05)；2.肩标不同的小写字母表示差异显著(P<0.05)；3.肩标不同的大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下同

2.2 ZEA对小鼠血清抗氧化指标的影响饲料中添加不同水平ZEA对小鼠血清中抗氧化指标的影响见表2。发情前期,试验2、3组的总抗氧化能力极显著低于对照组(P<0.01)，试验1组与对照组比较差异不显著(P>0.05)；3个试验组的丙二醛水平均极显著高于对照组(P<0.01)，T-SOD、GSH-Px活性均极显著低于对照组(P<0.01)。发情期,试验2、3组的总抗氧化能力极显著低于对照组(P<0.01)，试验1组与对照组比较差异不显著(P>0.05)；与对照组比较，试验2、3组的丙二醛水平极显著升高(P<0.01)，3个试验组T-SOD活性极显著降低(P<0.01)，试验2、3组的GSH-Px活性极显著降低(P<0.01)，试验1组的GSH-Px活性显著降低(P<0.05)。

表2 不同添加水平ZEA对小鼠血清抗氧化指标的影响

2.3 ZEA对小鼠肝脏、肾脏组织结构的影响饲料中添加ZEA饲喂小鼠20 d后，对小鼠肝脏结构的影响见图1。发情前期对照组(图1A)、试验1组(图1B)、2组(图1C)组和3组(图1D)的肝脏结构基本正常，试验1组和3组肝细胞出现了轻微的脂肪变性，试验2组小叶周边偶见局灶性坏死。在发情期，试验1组和2组的肝细胞索均发生紊乱(图1F,G)，试验1组(图1F)肝细胞脂肪变性，部分肝细胞核体积增大、深染，双核肝细胞数量增多，近中央静脉处肝细胞可见局灶性坏死,小叶周边肝细胞坏死；试验2组(图1G)体积明显增大且细胞核深染的肝细胞数量增多，肝血窦淤血；试验3组(图1H)肝细胞数量增多，部分细胞核体积增大。对照组(图1E)多见双核肝细胞。

图1 ZEA对不同阶段各组小鼠肝脏结构的影响(标尺示20 μm,HE染色,粗箭头示双倍DNA肝细胞，细箭头示双核肝细胞) A～D.分别为发情前期对照组、试验1组、试验2组和试验3组小鼠肝脏，试验1组、试验2组和试验3组的肝细胞出现程度不同的脂肪变性；E～H.分别为发情期对照组、试验1组、试验2组和试验3组小鼠肝脏，试验1组、试验2组肝细胞索紊乱，双核肝细胞和双倍DNA肝细胞增多

2.4 ZEA对小鼠肾组织结构的影响显微镜观察显示，各试验组肾小体出现不同程度的萎缩，血管球肿胀，充满肾小囊，肾间质毛细血管扩张，充满血液。试验3组肾小管刷状缘脱落，肾间质毛细血管显著扩张(图2)。

3 讨论

3.1 ZEA 对血清中代谢产物的影响血清总蛋白(TP) 是血清中所含各种蛋白质的总称，主要由肝脏合成。血清总蛋白含量的变化可以反应肝脏的合成功能和肾脏功能障碍时蛋白质损失情况。本试验中，各试验组TP含量均表现不同程度的升高，尤其是发情前期试验1组以及发情期3个试验组总蛋白水平均极显著升高，结合本试验肝脏的病理组织学观察结果，随着ZEA添加剂量的增加，发情期肝脏中双核肝细胞数量增多，这可能增强肝脏蛋白质合成功能，提示本试验剂量的ZEA没有导致肝脏的蛋白质合成功能受损。饲粮中ZEA添加量达到150 mg/kg时，血清总蛋白水平开始下降。

图2 ZEA对不同阶段的各组小鼠肾结构的影响(标尺示20 μm,HE染色,裸箭头示肾小体，粗箭头示肾小管) A～D分别为发情前期对照组、试验1组、试验2组和试验3组小鼠肾脏，试验1组血管球肿胀，充满肾小囊，试验2组和3组的肾小体萎缩；E～H分别为发情期对照组、试验1组、试验2组和试验3组小鼠肾脏，试验2组和3组的肾小体萎缩，试验3组肾小管刷状缘脱落

尿素氮(BUN)是机体蛋白质代谢的终产物，肾脏是其排泄的主要器官，肾实质的损伤将增加尿素氮的含量，临床上常常将BUN作为判断肾小球滤过功能的指标，是目前广泛应用的重要的肾毒性标志物，同时也是反应蛋白质代谢的重要指标。本试验中，饲喂含有不同水平的ZEA的饲料后， 100～150 mg/kg添加量的ZEA极显著提高了各试验组BUN含量，能够对机体产生较强的肾脏毒性。本研究肾脏的病理组织学观察进一步证实了ZEA对肾脏的毒性损伤。研究证实，累积在肝脏、肾脏的ZEA能够诱导肾小管上皮细胞萎缩变性，肾小体萎缩，滤过间隙缩小，导致血清中尿素氮升高[11-12]。

血脂主要包括胆固醇(TC)和三酰甘油(TG)，肝脏是合成TC 和 TG 的主要场所，血清 TC 和 TG 含量反映机体脂质代谢水平。血清胆固醇包括 HDL 和 LDL，LDL 的作用是将胆固醇带入血管壁内并沉积下来，而 HDL 则可以清除黏附在血管壁内的胆固醇，降低血脂。血清三酰甘油是脂类代谢过程产生的主要物质之一。本试验结果表明，饲料中添加ZEA对甘油三酯没有显著影响，但是总胆固醇含量和低密度脂蛋白、高密度脂蛋白增加，提示脂代谢受到一定程度的影响。成人肝脏和小肠可提供约90%的内源性胆固醇，血清胆固醇增高也多见于肾病综合征。本试验结果提示，试验剂量的ZEA对小鼠肝脏组织结构虽然造成了轻微损伤，但是脂代谢指标，尤其是对LDL含量的影响最为显著。

3.2 对机体抗氧化能力的影响氧化应激是指机体的氧化和抗氧化作用失衡，氧化程度超过了氧化物的清除，从而导致组织损伤。T-AOC、T-SOD和GSH-Px是反映机体清除体内活性氧和自由基，保护机体免受氧化损伤的重要指标。肝脏和肾脏是真菌毒素代谢的主要器官，当摄入过量真菌毒素时，肝、肾的抗氧化活性将发生变化。有研究结果显示，小鼠饲粮中添加含有霉菌毒素的玉米(AF， ZEN，DON)，肝脏、肾脏、脾脏的形态结构发生改变并增加其内脏指数，血清和肝脏GPx活性、MDA水平升高，肝、肾T-SOD降低[9]。本试验结果表明，添加100，150 mg /kg的ZEA，使发情期和发情前期血清中T-AOC、T-SOD、GSH-Px含量均极显著降低，血清中MDA含量极显著升高，添加量为50 mg /kg的ZEA时，发情期和发情前期血清T-SOD、发情前期的MDA和GSH-Px发生了极显著变化。BEN SALAH-ABBES等[13]也证实，饲料中含有ZEA降低小鼠抗氧化酶活性。当仔猪采食了含有镰刀菌毒素的饲料，血清中T-SOD、GSH-Px含量显著降低，MDA含量显著升高[14]，与本研究结果一致。 但是， ZEA单一毒素对肝、肾重量和细胞膜脂质完整性的作用可能与多种毒素的协同作用存在差别[15]。饲料中添加100～150 mg/kg ZEA后，发情前期和发情期血清中MDA含量极显著升高，T-AOC、 T-SOD、GSH-Px活性极显著降低。ZEA显著降低了机体的抗氧化能力，具有较强的肾脏毒性。