宁夏地区牛源肠球菌分离鉴定及耐药性与毒力基因检测

王 曈，万佳宏，常佳伟，魏彦琴，马 强，杨 敏，梁思慧，王玉霞，王桂琴

(宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750021)

肠球菌(Enterococcus)是一种兼性厌氧性革兰阳性菌，属于人和动物肠道内的共生细菌，现已成为主要的机会致病菌[1]。在肠球菌属中，粪肠球菌和屎肠球菌可导致人类和动物的许多感染，如心内膜炎，败血症等[2]。据报道，肠球菌可引起某些动物的感染，如犊牛腹泻[3]、仔猪关节炎[4]、羔羊脑炎[5]等，对养殖业带来经济损失。自20世纪80年代以来，随着耐万古霉素肠球菌(VRE)的出现，肠球菌耐药菌株不断增加，对肠球菌耐药性的研究越来越受到关注。

宁夏地区奶牛养殖业发展迅速，然而随着该地区奶牛产业的快速发展，滥用抗生素现象愈发严重，导致肠球菌的耐药菌株不断出现，给养牛业的发展和人类健康带来潜在危害。为了了解宁夏地区牛源肠球菌的耐药性及耐药基因和毒力基因的携带情况，本试验对宁夏地区规模化养殖场分离的肠球菌进行了抗菌药物的敏感性试验及相关耐药基因与毒力基因的检测，以期掌握宁夏地区牛源肠球菌的耐药情况，为指导奶牛场临床合理用药提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源255株肠球菌试验菌株为2016-2018年从宁夏地区规模化养殖牛场奶牛肛门拭子分离鉴定并收集。肠球菌标准株ATCC29212，购自中国药品生物制品检定所。

1.2 主要试剂与仪器BHI肉汤培养基、LB肉汤培养基、6.5%NaCl营养肉汤培养基、MH(A)琼脂培养基购自北京陆桥技术有限公司；肠球菌显色培养基购自青岛高科园海博生物技术有限公司；细菌基因组提取试剂盒、溶菌酶、溶葡萄球菌素及PCR相关试剂购自天根生化科技(北京)有限公司；16种药敏纸片购自Oxoid公司。

电热恒温培养箱(DNP-9272)购自上海精宏实验设备有限公司；超净工作台(SW-CJ-2FD)购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂；自动立式压力蒸汽灭菌器购自上海申安医疗器械厂；移液器与小型台式离心机购自Eppendorf公司；电热恒温干燥箱(DGF25012C)购自重庆华茂仪器有限公司；PCR扩增仪(Veriti)购自Applied Biosystems公司；电泳仪购自北京市六一仪器厂；全自动凝胶成像系统购自Bio-Rad公司。

1.3 肠球菌的初步分离鉴定将采集的奶牛肛门拭子低温带回实验室，样品在6.5%NaCl营养肉汤中45℃、18～24 h预增菌进行选择性培养后，将培养物接种在肠球菌显色培养基上，37℃培养24 h，观察显色培养基上菌落形态并进行革兰染色镜检。

1.4 细菌基因组DNA提取按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书，提取经初步分离鉴定的肠球菌DNA，-20℃保存备用。

1.5 肠球菌的PCR鉴定参考文献[6-7]，合成肠球菌属、粪肠球菌、屎肠球菌的引物，引物信息见表1，引物均由上海生工有限公司合成。25 μL总反应体系为：混合酶12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上、下游引物各1.5 μL，DNA模版1 μL。反应条件为：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，退火(退火温度见表1)30 s，72℃延伸30 s，共29个循环；72℃延伸7 min。取PCR产物进行电泳，110 V电压电泳20 min，使用凝胶成像系统观察结果。将PCR电泳产物进行纯化回收，送至上海生工有限公司进行测序。测序结果通过NCBI上的BLAST进行同源性分析。

1.6 抗菌药物敏感性测定根据美国临床实验室标准委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推荐的药敏纸片琼脂扩散法(K-B法)测定255株肠球菌对16种抗菌药物的敏感性，以ATCC29212为质控菌株，结果判定严格根据CLSI标准。

1.7 耐药基因的检测参考文献[8-9]合成tetM、VanA、VanB、VanC、fexA、ermB、Aac(6)′aph(2)″、aph(3)′-Ⅲ、ant(6)′-Ⅰ引物，引物信息见表1。20 μL总反应体系为：混合酶7.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模版2 μL。反应条件为：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，退火(退火温度见表1)30 s，72℃延伸30 s，共27个循环；72℃延伸10 min。将PCR产物电泳、纯化回收，送至上海生工有限公司进行测序及分析。

1.8 毒力基因的检测参考文献[10-11]合成毒力基因acm、agg、clyA、efaA、esp、fsr、gelE的引物，引物信息见表1。反应体系及条件同1.7。

表1 相关基因引物序列

2 结果

2.1 肠球菌鉴定结果肠球菌在显色培养基上呈紫红色，表面光滑的小菌落(图1)，镜检形态呈球形，链状排列。经PCR鉴定，共分离鉴定出肠球菌255株，其中屎肠球菌(图2)有78株(30.59%)，粪肠球菌(图3)有53株(21.96%)，其他种类肠球菌124株，占比48.63%。

图1 肠球菌在显色培养基上的形态

图2 粪肠球菌PCR电泳图 M.DL2000 DNA Marker；N.阴性对照；1～4.检测菌株

2.2 药敏试验结果255株肠球菌对16种抗菌药物的耐药情况见表2。由表2可见，本地区肠球菌耐药情况较为严重，分别对屎肠球菌、粪肠球菌的耐药率进行统计发现，屎肠球菌和粪肠球菌的耐药率与总体耐药率基本一致，其中屎肠球菌对环丙沙星、左氧氟沙星、利奈唑胺的耐药率高于粪肠球菌对其的耐药率，但经统计学分析，屎肠球菌与粪肠球菌的耐药率并无显著差异(P>0.05)。对肠球菌多重耐药情况的统计结果见图4。从图4可以看出，宁夏地区牛源肠球菌多重耐药情况比较严重，其中五耐和六耐居多，占比超过50%。没有对所有药物敏感的菌株，最少的耐2种药物，最多对耐13种药物均耐药，多重耐药菌株占98.82%。

图3 屎肠球菌PCR电泳图 M.DL2000 DNA Marker；N.阴性对照；1～3.检测菌株

表2 255株肠球菌对16种抗菌药物的耐药情况

图4 肠球菌多重耐药情况

2.3 肠球菌分离株耐药基因PCR检测结果255株肠球菌耐药基因携带情况见表3。结果显示，氨基糖苷类耐药基因aph(3)′-Ⅲ、aac(6)′/aph(2″)、ant(6)′-Ⅰ的检出率最高，分别为100%、94.90%和82.35%；其次是红霉素类耐药基因ermB，检出率为46.27%，四环素类耐药基因tetM的检出率为25.49%，未检出耐万古霉素耐药基因VanA、VanB和VanC。

表3 255株肠球菌耐药基因检出结果

2.4 肠球菌分离株毒力基因PCR检测结果255株肠球菌毒力基因携带情况见表4。由表4可见，毒力基因明胶酶gelE的携带率最高，为37.60%，其次为心内膜炎抗原efaA，检出率为36.10%，其余毒力基因的检出率在9%～21%。

表4 255株肠球菌毒力基因检出结果

3 讨论

本试验结果显示，从宁夏地区分离的255株牛源肠球菌的耐药水平较高，其中最少的耐2种药物，最多的已经耐13种药物，耐药情况较为严重。其中，该地区牛源肠球菌对红霉素的耐药率为65.92%，低于候书宝等[12]报道的牛源肠球菌对红霉素耐药率98.4%；而对四环素的耐药率与候书宝等[12]报道的结果较为接近； BARLOW等[13]报道的分离自澳大利亚地区牛源肠球菌对四环素和红霉素的耐药率分别为13.0%和13.6%，这与本地区牛源肠球菌对这2种药的耐药率有较大差异，原因可能是不同地区用药水平不同，宁夏地区对该药用药频率较高，导致细菌的选择压力增大，因此耐药率高于澳大利亚地区。李金磊等[14]报道的河南地区鸡源与猪源肠球菌对青霉素的耐药率分别为100%和69.59%，均高于本地区牛源肠球菌对青霉素的耐药率56.86%，这是因为不同动物的用药习惯不同，并且奶牛场用药相对较少，导致不同动物源细菌对同种药物的耐药率差异较大。

将宁夏地区牛源肠球菌耐药基因型与毒力基因型的检测结果与侯书宝等[12]、邓立新等[15]和高昇等[16]的相关基因检测结果进行比较，发现基因的检出率存在差异，说明不同地区的肠球菌存在着种间差异，携带的基因也不尽相同。耐药基因检测结果发现，本地区氨基糖苷类耐药基因携带率较高，均在80%以上，但对氨基糖苷类药物庆大霉素的耐药率为54.51%，庆大霉素的耐药表型与其基因型不一致，这说明该地区肠球菌可能还有其他的耐药基因或耐药机制[17]。本试验中，牛源肠球菌对红霉素的耐药率(65.88%)和其相关耐药基因ermB的检出率(46.27%)较高，表明菌株对红霉素的耐药比较严重，而ermB基因编码红霉素甲基化酶，能够使红霉素对细菌的作用靶位发生改变，从而对大环内酯类药物产生耐药[18]。因此，在该地区选择临床用药时，应谨慎选择该药。

由gelE基因编码的明胶酶，能酶解宿主细胞中的胶原蛋白，使肠球菌易感染宿主。esp基因则与细菌形成生物被膜相关[19]。HAMMERUM等[20]报道的丹麦地区猪源肠球菌esp基因携带率为8%，而人源肠球菌esp基因携带率为41.70%，而在本试验中，esp基因的检出率为19.60%，低于该地区人源肠球菌但高于猪源肠球菌该基因的携带率。黄奕雯等[21]报道，江西地区猪源肠球菌gelE基因携带率为58.74%，高于本地区牛源肠球菌的携带率37.60%。在不同动物之间，毒力基因普遍存在[22]，而不同地区或不同动物源所携带的毒力基因比例存在差异。

近些年来，牛场为了预防某些疾病，选择使用抗菌药，其中不乏滥用抗菌药现象的存在，那些对抗菌药耐药的细菌(AMR)，可以通过多种途径传播给人类，如通过食物或直接接触动物[10,23]，对人类的健康存在威胁。从本试验研究结果来看，宁夏地区肠球菌多重耐药结果不容乐观，对磺胺异噁唑、杆菌肽、红霉素和四环素耐药情况非常严重，因此，在临床选择用药上，应避免使用这些耐药率高的药物，选择使用耐药率较低的药物，避免长期使用同种药物，造成细菌产生耐药性。在宁夏地区应做好耐药性监测工作，通过药敏试验结果指导牛场合理用药，尽量减少抗菌药物的使用，减少耐药基因的传播。